ENZIMAS DE DETECCIÓN DEL ARN.

- Una composición que comprende una enzima nucleasa 5' que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2857

Campo de la invención

La presente invención se refiere a enzimas novedosas diseñadas para dirigir la detección, caracterización y cuantificación de ácidos nucleicos, particularmente del ARN La presente invención proporciona enzimas que reconocen las estructuras de escisión específicas del ácido 5 nucleico formadas en una secuencia de ARN diana y que escinden la estructura de escisión del ácido nucleico de una manera específica del sitio para producir productos de escisión no diana. La presente invención proporciona enzimas que tienen una capacidad mejorada de escindir de manera específica un miembro del ADN de un complejo que comprende hebras de ácido nucleico ADN y ARN. 10

Antecedentes de la Invención

En medicina molecular, un procedimiento simple y económico para la detección directa y cuantificada del ARN podría facilitar en gran medida el análisis de los virus de ARN y la medida de la expresión específica del gen. Ambas cuestiones son actualmente problemas urgentes en la 15 práctica. A pesar de esta necesidad, han aparecido pocas técnicas que sean verdaderamente directas. Los ensayos de detección basados en la PCR requieren la conversión del ARN en ADN mediante la transcriptasa inversa antes de la amplificación, introduciendo una variable que puede comprometer una cuantificación fiable. Además, la PCR y otros procedimientos basados en la amplificación exponencial (por ejemplo, NASBA) requieren meticulosas medidas de contención 20 para evitar la contaminación cruzada, y tienen dificultades en distinguir pequeñas diferencias (por ejemplo, 2 a 3 veces) en la cantidad. Otros ensayos que examinan directamente el ARN adolecen de una variedad de inconvenientes, entre las que se incluyen etapas de autorradiografía que consumen tiempo (por ejemplo, ensayos de protección de la RNasa), o tiempos de reacción durante la noche (por ejemplo, ensayos de ADN ramificado). Puesto que se llevan a cabo 1,5 25 millones de medidas de carga vírica en los Estados Unidos cada año, existe de forma clara un enorme potencial para un sistema de alto rendimiento, rápido y barato para la medida cuantitativa del ARN.

Las técnicas para la detección directa y cuantificada del ARNm son vitales para vigilar la expresión de numerosos genes diferentes. En particular, se están aprovechando los niveles de 30 expresión de las citocinas (por ejemplo, interleucinas y linfocinas) como medidas clínicas de la respuesta inmune en la progresión de una amplia variedad de enfermedades (Van Deuren y col., J. Int. Fed. Clin. Chem., 5: 216 [1993], Van Deuren y col., J. Inf. Dis., 169: 157 [1994], Perenboom y col., Eur. J. Clin. Invest., 26: 159 [1996], Guidotti y col., Immunity 4: 25 [1996]), así como en la vigilancia de los receptores de trasplantes (Grant y col., Transplantation 62: 910 [1996]). 35 Adicionalmente, la vigilancia de la carga vírica y la identificación del genotipo vírico tienen gran significancia clínica para los individuos que padecen infecciones víricas por dichos patógenos como VIH o virus de la Hepatitis C (VHC). Existe una elevada correlación entre la carga vírica (es decir, el número absoluto de partículas víricas en el torrente sanguíneo) y el tiempo de progresión del SIDA (Mellors y col., Science 272: 1167 [1996], Saag y col., Nature Medicine 2: 625 [1996]). 5 Por esta razón, la carga vírica, tal como se mide mediante el ensayo cuantitativo basado en ácido nucleico, es un procedimiento de vigilancia normalizado apropiado para evaluar la eficacia del tratamiento y del estado clínico de los pacientes VIH positivos. Se cree que es esencial reducir la carga vírica tan pronto como sea posible en el curso de la infección y evaluar los niveles víricos de forma regular. En el caso del VHC, el genotipo vírico tiene una gran significancia clínica, con 10 correlaciones para la gravedad de la enfermedad hepática y sensibilidad a la terapia del interferón. Además, debido a que no se puede hacer crecer el VHC en un cultivo, es solo estableciendo correlaciones entre las probables características del genotipo vírico y el resultado clínico que se pueden evaluar los nuevos tratamientos antivíricos.

Aunque los procedimientos anteriormente mencionados han sido prácticos para 15 aplicaciones de investigación con bajo rendimiento, o para una aplicación clínica limitada, es evidente que el análisis cuantitativo del ARN a gran escala fácilmente adaptable a cualquier sistema genético requerirá un enfoque más innovador. Un procedimiento de detección directa ideal combinaría las ventajas de los ensayos de detección directa (por ejemplo, fácil cuantificación y mínimo riesgo de contaminación cruzada) con la especificidad proporcionada por un ensayo de 20 doble hibridación de oligonucleótidos.

Muchos de los procedimientos descritos anteriormente dependen solo de la hibridación para distinguir una molécula diana de otros ácidos nucleicos Aunque algunos de estos procedimientos pueden ser muy sensibles, no pueden a menudo cuantificar y distinguir de manera precisa los ARNm estrechamente relacionados, especialmente, los mencionados ARN expresados 25 a diferentes niveles en la misma muestra. Aunque los procedimientos anteriormente mencionados son prácticos para algunos objetivos, existe la necesidad de una tecnología que sea particularmente acertada para distinguir los ARN particulares de las moléculas estrechamente relacionadas.

UNIPROT, con Número de Acceso P52028, da a conocer la secuencia de aminoácidos de 30 la ADN polimerasa de Thermus termophilus.

El documento WO 0190337 A2 da a conocer otra ADN polimerasa como la SEQ ID NO: 104

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Resumen de la invención

La presente invención se define en las reivindicaciones y se refiere a enzimas novedosas diseñadas para dirigir la detección, caracterización y cuantificación de ácidos nucleicos, particularmente del ARN. La presente invención proporciona enzimas que reconocen estructuras de escisión específicas del ácido nucleico formado sobre una secuencia de ARN diana y que 5 escinden la estructura de escisión del ácido nucleico de una manera específica del sitio para producir productos de escisión no dianas. La presente invención proporciona enzimas que tienen una capacidad mejorada para escindir específicamente un miembro de ADN de un complejo que comprende cadenas de ácido nucleico de ADN y ARN.

La invención proporciona una composición que comprende una enzima nucleasa 5' que 10 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2857. La invención proporciona un kit que comprende la composición de la reivindicación 1. La invención proporciona un procedimiento para escindir un ácido nucleico que comprende: a) proporcionar; i) la enzima de la reivindicación 1; y ii) una muestra que comprende ácido nucleico sustrato; y b) exponer dicho ácido nucleico sustrato a dicha enzima. 15

La presente invención se refiere a agentes de escisión específicos de estructura (por ejemplo, nucleasas) procedentes de una variedad de fuentes, entre las que se incluyen organismos mesófilos, psicrófilos, termófilos, e hipertermófilos. Las nucleasas específicas de estructura preferidas son termoestables. Las nucleasas termoestables específicas de estructura se contemplan como particularmente útiles ya que funcionan a una temperatura a la que la 20 hibridación del ácido nucleico es extremadamente específica, permitiendo la detección específica de alelo (que incluye emparejamientos incorrectos de bases únicas). Las nucleasas termoestables específicas de estructura relacionadas son nucleasas 5' termoestables que comprenden polimerasas alteradas derivadas de polimerasas naturales de especies de Thermus, que incluyen, pero no se limitan a Thermus aquaticus, Thermus flavus, y Thermus termophilus. Sin embargo, la 25 invención no se limita al uso de nucleasas 5' termoestables. Están también relacionadas las nucleasas específicas de estructura termoestable procedentes de las nucleasas de tipo FEN-1, RAD2 y XPG. La invención proporciona la nucleasa 5' de las reivindicaciones 1 a 4.

La presente invención proporciona un procedimiento para detectar una secuencia diana (por ejemplo, una mutación, polimorfismo, etc), que comprende proporcionar una muestra 30 sospechosa de contener la secuencia diana; oligonucleótidos capaces de formar una estructura de escisión invasiva en presencia de la secuencia diana; y un agente para detectar la presencia de una estructura de escisión invasiva; y exponer la muestra a los oligonucleótidos y al agente. En formas de realización relacionadas, el...

1. Una composición que comprende una enzima nucleasa 5' que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2857.

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2. Una composición que comprende un ácido nucleico que codifica la enzima de la Reivindicación 1, en la que dicho ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2856.

3. La composición de la Reivindicación 2 que comprende además un vector de expresión, 10 comprendiendo dicho vector de expresión dicho ácido nucleico de la Reivindicación 2.

4. Una composición que comprende una célula huésped que contiene el vector de expresión de la Reivindicación 3.

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5. Un kit que comprende la composición de la Reivindicación 1.

6. El kit de la Reivindicación 5, que comprende además al menos un sustrato de escisión del ácido nucleico.

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7. El kit de la Reivindicación 6, que comprende además al menos un ARN capaz de hibridarse con dicho sustrato de escisión del ácido nucleico.

8. El kit de la Reivindicación 5, que comprende además un oligonucleótido marcado.

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9. El kit de la Reivindicación 5, que comprende además un oligonucleótido invasivo.

10. Un procedimiento para escindir un ácido nucleico que comprende:

a) proporcionar:

i) la enzima de la Reivindicación 1; y 30

ii) una muestra que comprende ácido nucleico sustrato; y

b) exponer dicho ácido nucleico sustrato a dicha enzima.

11. El procedimiento de la Reivindicación 10, en el que dicha exposición de dicho ácido nucleico sustrato a dicha enzima produce al menos un producto de escisión. 35

12. El procedimiento de la Reivindicación 11, que comprende además la etapa de c) detectar dicho producto de escisión.

13. El procedimiento de la Reivindicación 10 que comprende un lisado celular que comprende ácido nucleico sustrato. 5