Escisión invasiva de ácidos nucleicos.

Un conjunto de reactivos para detectar una molécula de ácido nucleico diana que comprende:

a) un oligonucleótido sonda, en el que al menos una parte de dicho oligonucleótido sonda escomplementario a dicho ácido nucleico diana; y

b) una endonucleasa -1 Flap (FEN-1) termoestable purificada.

Escisión invasiva de ácidos nucleicos

Campo de la invención La presente invención se refiere a procedimientos para la detección y la caracterización de secuencias de ácidos nucleicos y de variaciones en las secuencias de ácidos nucleicos. La presente invención se refiere a procedimientos para formar una estructura de escisión de ácidos nucleicos sobre una secuencia diana y escindir la estructura de escisión de ácidos nucleicos en un modo de sitio específico. Se usa la actividad nucleasa 5’ de una variedad de enzimas para escindir la estructura de escisión dependiente de la diana, indicando así la presencia de secuencias de ácidos nucleicos específicas o variaciones específicas de las mismas. La presente invención proporciona además nuevos procedimientos y dispositivos para la separación de moléculas de ácido nucleico basados en la carga. La presente invención proporciona además procedimientos para la detección de productos de escisión no diana mediante la formación de una región activada y completa de unión proteínica.

Antecedentes de la invención La detección y la caracterización de secuencias de ácidos nucleicos específicas y de variaciones de secuencias se han utilizado para detectar la presencia de secuencias de ácidos nucleicos víricos o bacterianos indicadores de una infección, la presencia de variantes o alelos de genes de mamíferos asociados con enfermedades y cánceres, y la identificación del origen de los ácidos nucleicos encontrados en muestras forenses, así como en determinaciones de paternidad.

Hay diversos procedimientos conocidos en la técnica que se pueden usar para detectar y caracterizar secuencias de ácidos nucleicos específicas y variantes de secuencias específicas. No obstante, a medida que se van acumulando los datos de las secuencias de ácidos nucleicos del genoma humano, así como los genomas de organismos patógenos, continúa el crecimiento de la demanda de análisis rápidos, fiables, rentables y fáciles de usar para la detección de secuencias de ácidos nucleicos específicas. Lo más importante es que estos análisis deben ser capaces de crear una señal detectable procedente de muestras que contengan muy pocas copias de la secuencia de interés. La siguiente descripción examina dos niveles de análisis de detección de ácidos nucleicos que se encuentran actualmente en uso: I. Tecnología de amplificación de señales para la detección de secuencias raras y II. Tecnología de detección directa para la detección cuantitativa de secuencias.

I. Procedimientos de tecnología de amplificación de señales para amplificación La “reacción en cadena de la polimerasa” (PCR) comprende la primera generación de procedimientos para la amplificación de ácidos nucleicos. Sin embargo, se han desarrollado otros diversos procedimientos que emplean las mismas bases de especificidad, pero creando la señal mediante diferentes mecanismos de amplificación. Estos procedimientos incluyen la “reacción en cadena de la ligasa” (LCR) , “la reacción sintética auto–sostenida” (3SR/NASBA) y “la replicasa Qº” (Qº) .

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , según lo descrito en las patentes estadounidenses n.º: 4.683.195 y

4.683.202 concedidas a Mullis y Mullis et al., (cuyas revelaciones están incorporadas en la presente memoria por referencia) , describe un procedimiento para aumentar la concentración de un segmento de secuencia diana en una mezcla de ADN genómico sin realizar una clonación ni una purificación. Esta tecnología proporciona un enfoque dirigido a los problemas sobre la baja concentración de secuencia diana. La PCR se puede usar para aumentar la 40 concentración de la diana hasta un nivel fácilmente detectable. Este procedimiento para amplificar la secuencia diana implica introducir un exceso molar de dos cebadores de oligonucleótido que sean complementarios a sus respectivas cadenas de la secuencia diana bicatenaria en la mezcla de ADN que contenga la secuencia diana deseada. Se desnaturaliza la mezcla y luego se permite la hibridación. Tras la hibridación, se amplían los cebadores con polimerasa para formar cadenas complementarias. Las etapas de desnaturalización, hibridación y ampliación 45 con polimerasa se pueden repetir de la manera habitual, según lo necesario, para obtener concentraciones relativamente elevadas de un segmento de la secuencia diana deseada.

La longitud del segmento de la secuencia diana deseada está determinada por las posiciones relativas de los cebadores entre sí, y por lo tanto, esta longitud es un parámetro controlable. Como los segmentos deseados de la secuencia diana se vuelven secuencias dominantes (en términos de concentración) en la mezcla, se dice que están 50 “amplificados por PCR”.

Reacción en cadena de la ligasa (LCR o LAR)

La reacción en cadena de la ligasa (LCR; a veces denominada “reacción de amplificación de la ligasa” (LAR) descrita por Barany, Proc. Natl. Acad. Sci., 88:189 (1991) ; Barany, “PCR Methods and Applic.” 1: 5 (1991) ; y Wu y Wallace, Genomics 4:560 (1989) , ha evolucionado a un procedimiento alternativo muy reconocido para la 55 amplificación de ácidos nucleicos. En la LCR, cuatro oligonucleótidos, dos oligonucleótidos adyacentes que se hibridan de manera exclusiva con una cadena de ADN diana, y un conjunto complementario de oligonucleótidos adyacentes, que se hibrida con la cadena opuesta, se mezclan y se añade ADN ligasa a la mezcla. Siempre y cuando haya una complementariedad total en la unión, la ligasa se unirá mediante enlace covalente con cada conjunto de moléculas hibridadas. Lo importante es que, en la LCR, sólo se unen dos sondas cuando forman pares 5 de bases con secuencias en la muestra diana, sin huecos ni apareamientos erróneos. Los ciclos repetidos de desnaturalización, hibridación y unión amplifican un segmento corto de ADN. La LCR también se ha usado en combinación con la PCR para mejorar la detección de cambios de una sola base. Segev, Public. PCT n.º W09001069 A1 (1990) . Sin embargo, como los cuatro oligonucleótidos usados en este análisis se pueden aparear para formar dos fragmentos unibles cortos, existe la posibilidad de generar una señal de fondo independiente de la diana. El uso de la LCR para la detección de mutantes se limita al examen de posiciones específicas de ácidos nucleicos.

Reacción sintética auto–sostenida (3SR/NASBA)

La reacción de replicación de secuencias auto–sostenida (3SR) (Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:1874–1878 [1990], con una errata en Proc. Natl. Acad. Sci., 87:7797 [1990]) es un sistema de amplificación in vitro basado en la 15 transcripción (Kwok et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86:1 173–1177 [1989]) que puede amplificar exponencialmente secuencias de ARN a una temperatura uniforme. El ARN amplificado se puede utilizar luego para la detección de mutaciones (Fahy et al., PCR Meth. Appl., 1:25–33 [1991]) . En este procedimiento, se usa un cebador de oligonucleótido para añadir un promotor de ARN polimerasa de fago al extremo 5’ de la secuencia de interés. En una mezcla de enzimas y sustratos que incluye un segundo cebador, transcriptasa inversa, RNasa H, ARN polimerasa, y 20 trifosfatos de ribo– y desoxirribonucleósido, la secuencia diana se somete a repetidas series de transcripción, síntesis de ADNc y síntesis de segundas cadenas para amplificar la zona de interés. El uso de 3SR para detectar mutaciones está limitado cinéticamente para rastrear pequeños segmentos de ADN (p.ej., 200–300 pares de bases) .

Replicasa Q–beta (QI)

En este procedimiento, se une una sonda que reconoce la secuencia de interés al molde de ARN replicativo para la replicasa Q . Se ha abordado un problema importante identificado anteriormente con los falsos positivos resultantes de la replicación de sondas sin hibridar a través del uso de una etapa de unión de secuencia específica. Sin embargo, las ADN ligasas termoestables disponibles no son eficaces sobre este sustrato de ARN, por lo que la unión debe realizarse mediante ADN ligasa de T4 a temperaturas bajas (37°C) . Esto evita el uso de temper atura elevada como un procedimiento para alcanzar la especificidad como en la LCR, pudiéndose usar el evento de unión para detectar una mutación en el punto de unión, pero en ningún otro sitio.

En la tabla 1 que se presenta a continuación figuran algunas de las características deseables para los sistemas útiles en los diagnósticos de ácidos nucleicos sensibles y resume las capacidades de cada uno de los principales procedimientos de amplificación (véase,... [Seguir leyendo]

1. Un conjunto de reactivos para detectar una molécula de ácido nucleico diana que comprende:

a) un oligonucleótido sonda, en el que al menos una parte de dicho oligonucleótido sonda es complementario a dicho ácido nucleico diana; y

b) una endonucleasa -1 Flap (FEN-1) termoestable purificada.

2. Un conjunto de reactivos para formar una estructura de escisión con un ácido nucleico diana, teniendo dicho ácido nucleico diana una primera región, una segunda región, una tercera región y una cuarta región, en el que dicha primera región está localizada adyacente a y hacia abajo de dicha segunda región, dicha segunda región está localizada adyacente a y hacia abajo de dicha tercera región y dicha tercera región está localizada adyacente a y hacia abajo de dicha cuarta región, comprendiendo:

a) un oligonucleótido sonda, teniendo dicho oligonucleótido sonda una parte 5’ y una parte 3’ en el que dicha parte 3’ de dicho oligonucleótido sonda contiene una secuencia de uno o más nucleótidos que es completamente complementaria a dicha tercera región de dicho ácido nucleico diana y en la que dicha parte 5’ de dicho oligonucleótido sonda contiene una secuencia de uno o más nucleótidos adyacente a dicha parte 3’ de dicho oligonucleótido sonda que es completamente complementaria a dicha segunda región de dicho ácido nucleico diana;

b) un segundo oligonucleótido que tiene una parte 5’ y una parte 3’ en el que dicha parte 5’ de dicho segundo oligonucleótido contiene una secuencia o uno o más nucleótidos que son completamente complementarios a dicha primera región de dicho ácido nucleico diana y en el que dicha parte 3’ de dicho segundo oligonucleótido es complementaria a dicha segunda región de dicho ácido nucleico diana o comprende o consiste en al menos un solo nucleótido que está apareado erróneamente a dicha segunda región de dicho ácido nucleico diana; y

c) una enzima termoestable que tiene actividad nucleasa 5’ y sustancialmente carece de actividad polimerasa de ácido nucleico.

3. El conjunto de reactivos de la Reivindicación 2, que comprende además un tercer oligonucleótido complementario a dicha cuarta región de dicho ácido nucleico diana.

4. El conjunto de reactivos de la Reivindicación 2, en el que un nucleótido terminal 3’ de dicha parte 3’ de dicho segundo oligonucleótido comprende un nucleótido que está apareado erróneamente al nucleótido en la posición correspondiente de dicho ácido nucleico diana.

5. El conjunto de reactivos de la Reivindicación 2, en el que dicha parte 3’ de dicho segundo oligonucleótido consiste en un solo nucleótido, dicha segunda región de dicho ácido nucleico diana consiste en un solo nucleótido, y en el que dicha parte 3’ de dicho segundo oligonucleótido está apareada erróneamente con dicha segunda región de dicho ácido nucleico diana, o en el que dicha parte 3’ de dicho segundo oligonucleótido consiste en un solo nucleótido, dicha segunda región de dicho ácido nucleico diana consiste en un solo nucleótido, y en el que dicha parte 3’ de dicho segundo oligonucleótido es complementaria a dicha segunda región de dicho ácido nucleico diana.

6. El conjunto de reactivos de la Reivindicación 2, en el que dicho terminal 3’ de dicha parte 3’ de dicho segundo oligonucleótido comprende una estructura de anillo aromático que no es una base.

7. El conjunto de reactivos de la Reivindicación 1 o Reivindicación 2, en el que dicha composición comprende además un soporte sólido, y en el que dicho oligonucleótido sonda preferiblemente está unido a dicho soporte sólido.

8. El conjunto de reactivos de la Reivindicación 2, en el que dicho segundo oligonucleótido está unido a dicho soporte sólido.

9. El conjunto de reactivos de la Reivindicación 2, en el que dicha enzima termoestable comprende una secuencia de aminoácidos, en el que en una parte de la secuencia de aminoácidos de dicha enzima termoestable es homóloga a una parte de una secuencia de aminoácidos de una ADN polimerasa termoestable derivada de una especie de Thermus.

10. El conjunto de reactivos de la Reivindicación 9, en el que dicha enzima termoestable tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID N.º 61, 66, 69 y 71.

11. El conjunto de reactivos de la Reivindicación 2, en el que dicha enzima termoestable comprende una endonucleasa-1 Flap (FEN-1) , y en el que dicha endonucleasa-1 Flap (FEN-1) preferiblemente procede de una arqueabacteria.

12. El conjunto de reactivos de la Reivindicación 11, en el que dicha arqueabacteria está seleccionada del grupo que cosiste en Methanococcus jannaschii, Pyrococcus woesei y Pyrococcus furiosus.

13. El conjunto de reactivos de la Reivindicación 11, en el que dicha endonucleasa-1 Flap (FEN-1) comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID N.º 75, o en el que dicha nucleasa FEN-1 comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 79.

14. El conjunto de reactivos de la Reivindicación 1 o Reivindicación 2, en el que dicho oligonucleótido sonda

comprende además una parte terminal 5’ que no es complementaria a dicho ácido nucleico diana, y preferiblemente comprende además una solución tampón, y preferiblemente comprende además cebadores de amplificación capaces de amplificar dicho ácido nucleico diana.