Una composición que comprende una endonucleasa FEN-1 purificada de Archaeaglobus veneficus,

en la que dicha endonucleasa FEN-1 comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº 370.

Endonucleasas Fen

Campo de la invención

La presente invención se define en las reivindicaciones y proporciona nuevos agentes de escisión y polimerasas para la escisión y modificación de ácido nucleico. Los agentes de escisión y las polimerasas encuentran utilidad para, por ejemplo, la detección y caracterización de secuencias de ácido nucleico y variaciones en las secuencias de ácido nucleico. En algunas realizaciones, la actividad 5' nucleasa de varias enzimas se usa para escindir una estructura de escisión dependiente de diana, de modo que indica la presencia de secuencias específicas de ácido nucleico o variaciones específicas de las mismas.

Antecedentes de la invención

La detección y caracterización de secuencias específicas de ácido nucleico y variaciones de las secuencias se han utilizado para detectar la presencia de secuencias de ácido nucleico víricas o bacterianas indicativas de una infección, para detectar la presencia de variantes o alelos de genes de asociados con enfermedad y cánceres. Estos procedimientos también encuentran aplicación en la identificación de fuentes de ácidos nucleicos, como para análisis forenses o para determinaciones de paternidad.

En la técnica se conocen diversos procedimientos que se pueden usar para detectar y caracterizar secuencias específicas de ácido nucleico y variantes de secuencia. Sin embargo, con la finalización de la secuenciación de ácido nucleico del genoma humano, así como de los genomas de numerosos organismos patógenos, la demanda de ensayos rápidos, fiables, económicos y cómodos para el usuario para la detección de secuencias específicas de ácido nucleico continúa creciendo. Lo que es aún más importante, estos ensayos tienen que ser capaces de crear una señal detectable a partir de muestras que contengan muy pocas copias de la secuencia de interés. La siguiente discusión examina dos niveles de ensayos de detección de ácido nucleico que se usan actualmente: I. Tecnología de Amplificación de Señal para detección de secuencias raras; y II. Tecnología de Detección Directa para la detección cuantitativa de secuencias.

I. Procedimientos de Tecnología de Amplificación de Señal para Amplificación

La "Reacción en Cadena de la Polimerasa" (PCR) comprende la primera generación de procedimientos para la amplificación de ácido nucleico. Sin embargo, se han desarrollado varios procedimientos diferentes que emplean la misma base de especificidad, pero que crean señal mediante diferentes mecanismos de amplificación. Estos procedimientos incluyen la "Reacción en Cadena de la Ligasa (LCR) ", "Reacción Sintética Auto-Mantenida" (3SR/NASBA) y "Replicasa Q " (Q ) .

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , como se describe en las Patentes de EE.UU. Nº 4.683.195.

4.683.202. y 4.965.188 de Mullis y Mullis y col. describe un procedimiento para aumentar la concentración de un segmento de secuencia diana en una mezcla de ADN genómico sin clonación o purificación. Esta tecnología proporciona una enfoque para los problemas de una baja concentración de secuencia diana. Se puede usar la PCR para aumentar directamente la concentración de la diana hasta un nivel fácilmente detectable. Este procedimiento para amplificar la secuencia diana implica introducir un exceso molar de los dos cebadores oligonucleotídicos que son complementarios con sus cadenas respectivas de la secuencia diana de doble hélice a la mezcla de ADN que contiene la secuencia diana deseada. La mezcla se desnaturaliza y después se deja hibridar. Después de la hibridación, los cebadores se extienden con polimerasa para formar cadenas complementarias. Las etapas de desnaturalización, hibridación y extensión por polimerasa se pueden repetir tan a menudo como sea necesario, para obtener concentraciones relativamente altas de un segmento de la secuencia diana deseada.

La longitud del segmento de la secuencia diana deseada se determina mediante las posiciones relativas de los cebadores entre sí y, por lo tanto, esta longitud es un parámetro controlable. Debido a que los segmentos deseados de la secuencia diana se convierten en las secuencias dominantes (en términos de concentración) en la mezcla, se dice que se "amplifican por PCR".

Reacción en Cadena de la Ligasa (LCR o LAR)

La reacción en cadena de la ligasa (LCR; denominada en ocasiones "Reacción de Amplificación de la Ligasa" (LAR) descrita por Barany, Proc. Natl. Acad. Sci., 88: 189 (1991) ; Barany, PCR Methods and Applic., 1: 5 (1991) ; y Wu y Wallace, Genomics 4: 560 (1989) se ha desarrollado hasta un procedimiento alternativo bien reconocido para amplificar ácidos nucleicos. En la LCR se mezclan cuatro oligonucleótidos, dos oligonucleótidos adyacentes que hibridan de forma única con una hebra de ADN diana y un conjunto complementario de oligonucleótidos adyacentes, que hibridan con la hebra opuesta y se añade ADN ligasa a la mezcla. Con la condición de que haya una complementariedad completa en la unión, la ligasa ligará covalentemente cada conjunto de moléculas hibridadas. Lo que es aún más importante, en la LCR se ligan dos sondas entre sí solamente cuando tienen emparejamiento de bases con secuencias en la muestra diana, sin huecos o apareamientos erróneos. Ciclos repetidos de desnaturalización, hibridación y ligación amplifican un segmento corto de ADN. La LCR también se ha usado en combinación con PCR para conseguir una detección potenciada de los cambios de una única base. Segev, PCT Public. Nº W09001069 A1 (1990) . Sin embargo, debido a que los cuatro oligonucleótidos usados en este ensayo se pueden emparejar para formar dos fragmentos cortos que se pueden ligar, existe el potencial de la generación de señal de fondo independiente de diana. El uso de LCR para selección de mutantes está limitado al análisis de posiciones de ácido nucleico específicas.

Reacción Sintética Auto-Mantenida (3SR/NASBA)

La reacción de replicación de secuencia auto-mantenida (3SR) (Guatelli y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 1874-1878, [1990], con una errata en Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 7797 [1990]) es un sistema de amplificación in vitro basado en transcripción (Kwok y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 1173-11177 [1989]) que puede amplificar exponencialmente secuencias de ARN a una temperatura uniforme. Después, el ARN amplificado se puede utilizar para detección de mutaciones (Fahy y col. PCR Meth. Appl., 1:25-33 [1991]) . En este procedimiento se usa un cebador oligonucleotídico para añadir un promotor de ARN polimerasa de fago al extremo 5' de la secuencia de interés. En una combinación de enzimas y sustratos que incluye un segundo cebador, transcriptasa inversa, RNAsa H, ARN polimerasa y ribo- y desoxirribonucleósidos trifosfato, la secuencia diana experimenta rondas repetidas de transcripción, síntesis de ADNc síntesis de segunda hebra para amplificar el área de interés. El uso de 3SR para detectar mutaciones está limitado cinéticamente a la exploración de pequeños segmentos de ADN (por ejemplo, 200-300 pares de bases) .

Replicasa Q-Beta (QQ )

En este procedimiento, una sonda que reconoce la secuencia de interés se une al molde de ARN replicable para replicasa Q . Un problema principal que se ha identificado previamente con falsos positivos que se producen por la replicación de sondas no hibridadas se ha abordado mediante el uso de una etapa de ligación específica de secuencia. Sin embargo, las ADN ligasas termoestables disponibles no son eficaces sobre este sustrato de ARN, de tal forma que se tiene que realizar la ligación mediante ADN ligasa de T4 a temperaturas bajas (37 ºC) . Esto evita el uso de temperatura alta como un medio para conseguir especificidad como en la LCR, el acontecimiento de ligación se puede usar para detectar una mutación en el sitio de unión, pero no en otro lugar.

La siguiente tabla 1 enumera algunas de las características deseables para sistemas útiles en diagnósticos de ácido nucleico sensibles y resume las capacidades de cada uno de los principales procedimientos de amplificación (véase también Landgren, Trends in Genetics 9: 199 [1993]) .

Un procedimiento de diagnóstico exitoso tiene que ser muy específico. Un procedimiento sencillo para controlar la especificidad de hibridación de ácido nucleico es mediante el control de la temperatura de la reacción. Aunque la 3SR/NASBA y los sistemas Qß son todos capaces de generar una gran cantidad de señal, una o más de las enzimas implicadas en cada uno no se pueden usar a temperatura... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende una endonucleasa FEN-1 purificada de Archaeaglobus veneficus, en la que dicha endonucleasa FEN-1 comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº 370.

2. Una composición que comprende un ácido nucleico aislado, en el que dicho ácido nucleico codifica la endonucleasa de la reivindicación 1, en el que dicho ácido nucleico aislado comprende la SEC ID Nº 369.

3. Una composición que comprende una endonucleasa FEN-1 quimérica, comprendiendo dicha endonucleasa FEN-1 quimérica la endonucleasa de la reivindicación 1.

4. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 2.

5. Una composición que comprende una célula huésped, comprendiendo dicha célula huésped el vector de la reivindicación 4.

6. La composición de la reivindicación 3, en la que dicha endonucleasa FEN-1 quimérica comprende un dominio funcional.

7. La composición de la reivindicación 6, en la que dicha endonucleasa FEN-1 quimérica comprende la SEC ID Nº

370.

8. Una mezcla que comprende: i) una primera nucleasa con especificidad de estructura que comprende una endonucleasa FEN-1 de Archaeaglobus veneficus; y ii) una segunda nucleasa con especificidad de estructura, en la que dicha nucleasa con especificidad de estructura comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº 370.

9. La mezcla de la reivindicación 8, en la que dicha nucleasa específica de estructura purificada comprende una nucleasa específica de estructura de un organismo seleccionado del grupo que consiste en Sulfolobus solfataricus, Pyrobaculum aerophilum, Thermococcus litoralis, Archaeaglobus veneficus, Archaeaglobus profundus, Acidianus brierlyi, Acidianus ambivalens, Desulfurococcus amylolyticus, Desulfurococcus mobilis, Pyrodictium brockii, Thermococcus gorgonarius, Thermococcus zilligii, Methanopyrus kandleri, Methanococcus igneus, Pyrococcus horikoshii y Aeropyrum pernix.

10. La mezcla de la reivindicación 8, en la que dicha nucleasa específica de estructura purificada comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nº 337, 341, 345, 349, 353, 357, 361, 365, 375, 379, 384, 389, 394, 398, 402, 418, 426, 432, 436, 440, 444, 450, 452, 470, 472, 474, 476, 478, 480, 482, and

484.

11. La mezcla de la reivindicación 8, en la que dicha segunda nucleasa específica de estructura comprende una polimerasa.

12. La mezcla de la reivindicación 11, en la que dicha polimerasa comprende una ADN polimerasa.

13. La mezcla de la reivindicación 12, en la que dicha ADN polimerasa comprende una ADN polimerasa termoestable.

14. En La mezcla de la reivindicación 8, en la que dicha segunda nucleasa específica de estructura comprende una

nucleasa 5' derivada de una ADN polimerasa alterada en la secuencia de aminoácidos de tal forma que muestra actividad sintética de ADN reducida con respecto a la de la ADN polimerasa de tipo silvestre pero conserva sustancialmente la misma actividad nucleasa 5' de la ADN polimerasa de tipo silvestre.

15. La mezcla de la reivindicación 14, en la que dicha nucleasa 5' comprende una nucleasa en 5' termoestable.

16. La mezcla de la reivindicación 8, en la que dicha seguna nucleasa específica de estructura se selecciona del grupo que consiste en la enzima CLEAVASE BN, la enzima CLEAVASE DA, la enzima CLEAVASE DN, la enzima CLEAVASE DV, la enzima CLEAVASE BN/trombina, la enzima CLEAVASE TThDN, ADN polimerasa de Thermus aquaticus, ADN polimerasa de Thermus thermophilus, Exo III de Escherichia coli y complejo Rad1/Rad10 de Saccharomyces cerevisiae.

17. Un kit de tratamiento de ácido nucleico, que comprende:

a) una composición que comprende una endonucleasa FEN-1 purificada de Archaeaglobus veneficus, en la que dicha endonucleasa FEN1 comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº 370; y b) oligonucleótidos capaces de formar una estructura de escisión invasiva en presencia de un ácido nucleico diana.

18. El kit de la reivindicación 17, en el que dichos oligonucleótidos comprenden:

a) un primer oligonucleótido que comprende una porción en 5' complementaria de una primera porción de un ácido nucleico diana; y b) un segundo oligonucleótido que comprende: una porción en 5' complementaria de una segunda porción de dicho ácido nucleico diana cadena debajo de y contiguo a dicha primera porción; y una porción 3'.

19. El kit de la reivindicación 18, en el que dicha porción 3' de dicho segundo oligonucleótido comprende un nucleótido en 3' terminal no complementario a dicho ácido nucleico diana.

20. El kit de la reivindicación 19, en el que dicha porción 3' de dicho segundo oligonucleótido consiste en un único nucleótido no complementario a dicho ácido nucleico diana.

21. El kit de la reivindicación 18, que comprende un soporte sólido.

22. El kit de la reivindicación 21, en el que dicho primer oligonucleótido está unido a dicho soporte sólido.

23. El kit de la reivindicación 21, en el que dicho segundo oligonucleótido está unido a dicho soporte sólido.

24. El kit de la reivindicación 18, que además comprende una solución tampón.

25. El kit de la reivindicación 24, en el que dicha solución tampón comprende una fuente de cationes divalentes.

26. El kit de la reivindicación 25, en el que dicho catión divalente comprende Mn2+.

27. El kit de la reivindicación 25, en el que dicho catión divalente comprende Mg2+.

28. El kit de la reivindicación 18, que además comprende un tercer oligonucleótido complementario a una tercera porción de dicho ácido nucleico diana cadena arriba de la primera porción del primer ácido nucleico diana.

29. El kit de la reivindicación 28, que además comprende uno o más ácidos nucleicos diana.

30. Un procedimiento para detectar una secuencia diana, que comprende: a) proporcionar:

i) una estructura de escisión que comprende una secuencia Diana y oligonucleótidos capaces de formar una estructura de escisión invasive en presencia de dicha secuencia diana; y ii) una endonucleasa FEN-1 purificada de Archaeaglobus veneficus, en la que dicha endonucleasa FEN-1

comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº 370; y b) exponer dicha estructura de escisión a dicha endonucleasa FEN-1; y c) detectar la escisión de dicha estructura de escisión.

31. El procedimiento de la reivindicación 30, en el que dicha secuencia diana comprende una primera región y una segunda región, dicha segunda región cadena abajo y contigua a dicha primera región, y en la que dichos oligonucleótidos comprenden los oligonucleótidos primero y segundo, en la que dicha al menos una porción de dicho primer oligonucleótido es completamente complementaria a dicha primera porción de dicha secuencia diana y en la que dicho segundo oligonucleótido comprende una porción en 3' y una porción en 5', en la que dicha porción en 5' es completamente complementaria a dicha segunda porción de dicho ácido nucleico diana.

32. El procedimiento de la reivindicación 31, en el que dicha porción 3' de dicho segundo oligonucleótido comprende un nucleótido en 3' terminal no complementario a dicho ácido nucleico diana.

33. El procedimiento de la reivindicación 31, en el que dicha porción 3' de dicho segundo oligonucleótido consiste en un único nucleótido no complementario a dicho ácido nucleico diana.

34. El procedimiento de la reivindicación 31, en el que dicho primer oligonucleótido está unido a un soporte sólido.

35. El procedimiento de la reivindicación 31, en el que dicho segundo oligonucleótido está unido a un soporte sólido.

36. El procedimiento de la reivindicación 30, en el que exponer dicha estructura de escisión a dicha endonucleasa FEN-1 comprende exponer en presencia de una solución tampón que comprende una fuente de cationes divalentes.

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37. El procedimiento de la reivindicación 36, en el que dicho catión divalente comprende Mn2+.

38. El procedimiento de la reivindicación 36, en el que dicho catión divalente comprende Mg2+.

39. El procedimiento de la reivindicación 31, que además comprende un tercer oligonucleótido complementario a una tercera porción de dicho ácido nucleico diana cadena arriba de la primera porción de dicho ácido nucleico diana.