Procedimiento de detección de la expresión de una proteína de cubierta de un retrovirus endógeno humano y utilizaciones de un gen que codifica para esta proteína.

Procedimiento para detectar la expresión de una proteína de cubierta del retrovirus endógeno humano HERV-W que comprende o que consiste en SEC ID nº 1,

mediante una célula seleccionada de entre las células óseas, las células musculares, las células placentarias, las células endoteliales, en particular de los vasos sanguíneos, las células epiteliales, las células gliales y las células tumorales o procedentes de estirpes celulares tumorales, caracterizado porque

se pone en contacto dicha célula con una célula indicadora que expresa el receptor hATBº de la proteína de cubierta de HERV-W, y

se observa la formación de sincitio,

indicando la formación de sincitio la expresión de la proteína de cubierta de HERV-W,

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/FR2000/002429.

Solicitante: BIO MERIEUX.

Nacionalidad solicitante: Francia.

Dirección: CHEMIN DE L'ORME 69280 MARCY L'ETOILE FRANCIA.

Inventor/es: BLOND, JEAN-LUC, BOUTON, OLIVIER, MALLET, FRANCOIS, COSSET,FRANCOIS-LOIC, LAVILLETTE,Dimitri, RUGGIERI,Alessia.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61K31/7088 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 31/00 Preparaciones medicinales que contienen ingredientes orgánicos activos. › Compuestos que tienen al menos tres nucleósidos o nucleótidos.
  • A61K35/76 A61K […] › A61K 35/00 Preparaciones medicinales que contienen sustancias de constitución indeterminada o sus productos de reacción. › Virus; Partículas subvirales; Bacteriófagos.
  • A61K38/00 A61K […] › Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00).
  • A61K39/21 A61K […] › A61K 39/00 Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53). › Retroviridae, p. ej. virus de la anemia infecciosa equina.
  • A61K39/395 A61K 39/00 […] › Anticuerpos (aglutininas A61K 38/36 ); Inmunoglobulinas; Inmunosuero, p. ej. suero antilinfocitario.
  • A61K45/00 A61K […] › Preparaciones medicinales que contienen ingredientes activos no previstos en los grupos A61K 31/00 - A61K 41/00.
  • A61K48/00 A61K […] › Preparaciones medicinales que contienen material genético que se introduce en las células del cuerpo vivo para tratar enfermedades genéticas; Terapia génica.
  • A61P15/00 A61 […] › A61P ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS O DE PREPARACIONES MEDICINALES.Medicamentos para el tratamiento de trastornos genitales o sexuales (para trastornos de las hormonas sexuales A61P 5/24 ); Anticonceptivos.
  • A61P35/00 A61P […] › Agentes antineoplásicos.
  • C07K14/15 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Retroviridae, p. ej. virus de la leucemia bovina, virus de la leucemia felina, virus linfotrópico de células T humanas.
  • C12N1/15 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12N1/19 C12N 1/00 […] › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12N1/21 C12N 1/00 […] › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12N15/09 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.
  • C12N15/48 C12N 15/00 […] › Retroviridae, p. ej. virus de la leucemia bovina, virus de la leucemia felina.
  • C12N5/10 C12N […] › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus.
  • C12Q1/02 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen microorganismos vivos.

PDF original: ES-2376726_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Procedimiento de detección de la expresión de una proteína de cubierta de un retrovirus endógeno humano y utilizaciones de un gen que codifica para esta proteína.

Los retrovirus son unos virus envueltos que contienen unas espículas glicoproteicas codificadas por los virus en su superficie. Estas glicoproteínas de cubierta se sintetizan en forma de precursores poliproteicos (pre-env) que son escindidos después por unas proteasas celulares en proteína de superficie madura (SU) y en proteína transmembranaria (TM) . Las glicoproteínas de cubierta están implicadas en la entrada de los virus en las células huésped. Reconocen específicamente y se unen a unos receptores de superficie celular y son necesarias para la fusión de la cubierta viral y de las membranas celulares del huésped. El receptor y la cubierta son unas moléculas multiméricas u oligoméricas. Para todos los virus envueltos las interacciones de las glicoproteínas de cubierta con el o los receptores celulares conducen a unas reordenaciones conformacionales de la cubierta necesarias para la exposición del péptido de fusión. La fusión tiene lugar en la superficie de la célula o en unas vesículas celulares que siguen la vía de endocitosis del virión. Además, para permitir la entrada del virus, una fusión mediada por las proteínas de superficie puede, en ciertas condiciones, provocar una fusión célula con célula con el resultado de la formación de células multinucleadas gigantes o sincitio. La formación de sincitio se realiza mediante por lo menos dos vías: un virión se puede fusionar simultáneamente con dos células, se habla entonces de fusión "from without", o una célula infectada que expresa las glicoproteínas de cubierta a su superficie puede fusionar con una célula adyacente (fusión "from within") .

Los determinantes de la cubierta y la secuencia de los acontecimientos que causan los cambios conformacionales de la cubierta durante unos procesos de fusión "from without" están bien documentados para los ortomixovirus que necesitan un entorno ácido de las vesículas de endocitosis para su entrada (Skehel, J. J. et al., PNAS, 79:968-972 (1982) ) . Para los retrovirus, para los cuales la vía de entrada es independiente del pH, los determinantes precisos y las etapas, que condujeron al reconocimiento del receptor hasta la activación de la fusión no están todavía dilucidados. Otros retrovirus son conocidos por inducir una fusión célula a célula ("fusion from within") tales como el virus de la leucemia felina, el virus del tumor mamario del ratón, el virus de la reticuloendoteliosis aviar, VIH y SIV.

Por otra parte, Fefferey S. Jones y Rex Risser (Journal of Virology, Ene. 1993, p. 67-74) han demostrado que las glicoproteínas de cubierta del virus de la leucemia murina ecotrópica (MuLV) de tipo salvaje, bajo la dependencia del LTR viral, eran capaces de inducir la formación de sincitio en unas células de rata XC en ausencia de virión (fusión "from within") .

Según les consta a los inventores, no se ha demostrado jamás ningún poder fusogénico, en un proceso de fusión "from within" de las glicoproteínas de cubierta de un retrovirus endógeno humano.

Unos autores han emitido la hipótesis que la cubierta retroviral endógena de ERV3, un retrovirus endógeno humano parecido a MLV (Moloney Leukemia Virus) , podría estar implicada in vivo en la elaboración de la placenta por medio de un proceso de fusión (Patrick J. W. Venables et al., Virology, 211, 589-592 (1995) ) pero este fenómeno no se ha demostrado jamás in vitro. Por otra parte, los estudios sobre el polimorfismo de env ERV3, sobre unos individuos de origen caucásico, han permitido poner en evidencia la presencia de una mutación en la región (SU) de la cubierta ERV3 que genera un codón de terminación precoz presente en el estado de homocigoto en 1% de la población estudiada, sin que estos individuos presenten ninguna anomalía del embarazo o del desarrollo placentario (Nathalie de Parseval y Thierr y Heidmann, Journal of Virology, Vol. 72, nº 4, páginas 3442-3445 (1998) ) , poniendo así en duda la hipótesis emitida anteriormente.

Los presentes inventores han demostrado ahora in vitro que la glicoproteína de cubierta de HERV-W no modificada, expresada bajo la dependencia de un promotor, preferentemente un promotor heterólogo, posee unas propiedades fusogénicas.

HERV-W es una familia de retrovirus endógenos humanos muli-copia descrita recientemente, denominada así debido a la homología entre el sitio de fijación del cebador de la transcripción inversa y el de los retrovirus aviares que utilizan el ARNt Trp. No se ha evidenciado ninguna entidad competente para su replicación. Se ha verificado la funcionalidad de una región promotora y, entre diferentes tejidos humanos sanos testados, su expresión parece estar restringida a la placenta mediante transferencia Northem (J. L Blond et al., Journal of Virology, Vol. 73, nº 2, páginas 1175-1185 (1999) ) . En el cromosoma 7 existe un único marco de lectura abierto que codifica para una cubierta retroviral potencialmente funcional. Un clon ADNc que corresponde aparentemente a un transcrito subgenómico y que contiene la secuencia de la cubierta completa se aisló a partir de material placentario (clon cl. PH74, GenBank AF072506, cuya secuencia se identifica por SEC ID nº 2) . Los estudios filogenéticos efectuados al nivel proteico indican que la proteína de cubierta es de tipo D. La secuencia SEC ID nº 2 dada al final de la descripción corresponde por lo tanto a la secuencia nucleotídica en ADNc completa del clon cl.PH74 cuya secuencia proteica se identifica mediante SEC ID nº 1.

Env HERV-W posee todos los "atributos" de una cubierta retroviral: en particular, un péptido líder, las dos subunidades características SU y TM separadas por un sitio de escisión por las furinas y, al nivel de su TM, posee un péptido de fusión hidrófobo, una región inmunosupresiva y una región carboxilo transmembranaria seguida de una cola citoplásmica larga. La expresión de Env HERV-W se ha evidenciado en la placenta.

Los experimentos realizados por los inventores muestran que ENV HERV-W provoca, mediante fusión de célula con célula, la formación de sincitio en diferentes estirpes celulares testadas de origen humano y símico. El fenómeno de fusión observado depende del reconocimiento de receptor (es) específico (s) , tal como se muestra de manera directa durante transfecciones y de manera indirecta durante cocultivos de células transfectadas con otros tipos celulares. Los presentes inventores han identificado por otro lado el receptor específico de Env HERV-W mediante un enfoque de competición que se basa en la propiedad de interferencia de las cubiertas retrovirales, bloqueando unos receptores celulares mediante una proteína de cubierta diferente de Env HERV-W, impidiendo así la formación de sincitio. El receptor identificado por los presentes inventores es el receptor hATBº de los retrovirus de mamíferos de tipo D expresado en las células humanas (Rasko E. J. et al. PNAS, 1999, 96: 2129-2134 y Tailor C. S. et al. J. Virol., 1999, 73 (5) : 4470-4474) . El procedimiento de puesta en evidencia de este receptor se describe en uno de los ejemplos.

Se describe en él un procedimiento de detección de la expresión de una proteína o de un polipéptido de cubierta de un retrovirus endógeno humano, según el cual la proteína o el polipéptido presenta una secuencia polipeptídica que comprende la secuencia SEC ID nº 1 o un fragmento de SEC ID nº 1, o una secuencia que presenta, para cualquier sucesión de 20 aminoácidos, por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90% o también por lo menos 95% de similitud con la secuencia SEC ID nº 1 o con un fragmento de SEC ID nº 1, y según el cual se detecta el poder fusogénico de dicha proteína o de dicho fragmento en unas células de un tejido celular o de un cultivo celular, mediante la puesta en evidencia de la formación de sincitio.

Se describe asimismo un procedimiento de detección de la expresión de una proteína o de un polipéptido de cubierta de un retrovirus endógeno humano, según el cual la proteína o el polipéptido presenta una secuencia polipeptídica que presenta, para cualquier sucesión de 20 aminoácidos, por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90% o también por lo menos 95% de similitud con la secuencia SEC ID nº 1, y según el cual se detecta el poder fusogénico de dicha proteína en unas células de un tejido celular, o de un cultivo celular mediante la puesta en evidencia de la formación de sincitio.

Dicha proteína o dicho péptido presenta... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Procedimiento para detectar la expresión de una proteína de cubierta del retrovirus endógeno humano HERV-W que comprende o que consiste en SEC ID nº 1, mediante una célula seleccionada de entre las células óseas, las células musculares, las células placentarias, las células endoteliales, en particular de los vasos sanguíneos, las células epiteliales, las células gliales y las células tumorales o procedentes de estirpes celulares tumorales, caracterizado porque se pone en contacto dicha célula con una célula indicadora que expresa el receptor hATBº de la proteína de cubierta 10 de HERV-W, y se observa la formación de sincitio, indicando la formación de sincitio la expresión de la proteína de cubierta de HERV-W, 15

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína está codificada por un marco abierto de lectura situado en el cromosoma 7 del genoma humano.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque la secuencia peptídica de la proteína consiste en la 20 SEC ID nº 1.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicha célula se selecciona de entre unas células transfectadas por un vector de expresión de dicha proteína.


 

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