MATERIAL VIRAL Y FRAGMENTOS DE NUCLEOTIDOS ASOCIADOS A LA ESCLEROSIS MULTIPLE, PARA FINES DIAGNOSTICOS, PROFILACTICOS Y TERAPEUTICOS.

ESTA INVENCION SE REFIERE A UN MATERIAL NUCLEICO, EN ESTADO AISLADO O PURIFICADO,

QUE COMPRENDE UNA SECUENCIA NUCLEOTIDICA ESCOGIDA EN EL GRUPO CONSTITUIDO POR LAS SECUENCIAS SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, POR SUS SECUENCIAS COMPLEMENTARIAS Y POR SUS SECUENCIAS EQUIVALENTES, EN PARTICULAR LAS SECUENCIAS NUCLEOTIDICAS QUE PRESENTAN, PARA CUALQUIER SUCESION DE 100 MONOMEROS CONTIGUOS, AL MENOS EL 50% Y PREFERENTEMENTE, COMO MINIMO, EL 60% DE HOMOLOGIA CON DICHAS SECUENCIAS SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, Y CON SUS SECUENCIAS COMPLEMENTARIAS, EXCLUYENDO LA SECUENCIA HSERV - 9

Material viral y fragmentos de nucleótidos asociados a la esclerosis múltiple, para fines diagnósticos, profilácticos y terapéuticos.

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad desmielinizante del sistema nervioso central (SNC) cuya causa todavía se desconoce.

La esclerosis múltiple (EM) es la enfermedad neurológica más común entre adultos jóvenes, con una prevalencia en Europa y Norteamérica de 20 a 200 por cada 100.000 personas. Se caracteriza clínicamente por un curso recidivante/remitente o progresivo crónico que frecuentemente conduce a una discapacidad severa. Los conocimientos actuales sugieren que la EM se encuentra asociada a la autoinmunidad, que el contexto genético presenta una influencia importante y que podrían encontrarse implicados uno o más agentes "infecciosos". En efecto, se han propuesto muchos virus como posibles candidatos pero, hasta ahora, no se ha demostrado que ninguno de ellos desempeñe un papel etiológico.

Muchos estudios apoyan la hipótesis de una etiología vírica de la enfermedad, pero ninguno de los virus conocidos y sometidos a ensayo ha demostrado ser el agente causal buscado: una revisión de los virus buscados durante varios años en la EM ha sido compilada por E. Norrby (1) y R. T. Johnson (2).

Al descubrimiento de los retrovirus patogénicos en el hombre (HTLV y VIH) ha seguido un gran interés en su capacidad de alterar el sistema inmunológico y de provocar inflamación y/o degeneración del sistema nervioso central. En el caso de HTLV-1, su asociación con una enfermedad desmielinizante inflamatoria crónica en el ser humano (48) condujo a investigaciones extensas en busca de un retrovirus similar a HTLV1 en los pacientes de EM. Sin embargo, a pesar de las reivindicaciones iniciales, la presencia de HTLV-1 o de retrovirus similares a HTLV no ha sido confirmada.

Recientemente se ha aislado un retrovirus diferente de los retrovirus humanos conocidos a partir de pacientes que sufren EM (3, 4 y 5).

En 1989, los autores describieron la producción de viriones extracelulares asociados a actividad de transcriptasa inversa (RT) mediante un cultivo de células leptomeníngeas (LM7) obtenidas del líquido cerebroespinal (CSF) de un paciente con EM (3). Siguieron resultados similares en cultivos de monocitos procedentes de una serie de pacientes con EM (5). No se encontraron partículas víricas ni actividad vírica de RT en los individuos de control. Además, los autores pudieron transferir el virus LM7 a células leptomeníngeas no infectadas in vitro (26). La caracterización molecular del retrovirus "LM7" era una condición previa para la evaluación posterior de su posible papel en la EM. Se plantearon dificultades considerables debido a la ausencia de cultivos retrovíricos productivos en continuo y a los bajos niveles de expresión en los pocos cultivos transitorios conseguidos. La estrategia descrita en la presente memoria se centró en el ARN procedente de viriones extracelulares, con el fin de evitar la detección no específica de ARN celular y de elementos endógenos de ADN humano contaminante. Se identificó una secuencia retrovírica específica asociada a viriones producidos en cultivos celulares procedentes de varios pacientes con EM. La secuencia completa de este nuevo genoma retrovírico se está obteniendo en la actualidad utilizando PCR-RT en ARN procedente de viriones extracelulares. El retrovirus denominado anteriormente "virus LM7" corresponde a un oncovirus y se denomina MSRV (retrovirus asociado a esclerosis múltiple).

Los autores también pudieron demostrar que dicho retrovirus podía transmitirse in vitro, que los pacientes que sufrían EM producían anticuerpos capaces de reconocer proteínas asociadas a la infección de células leptomeníngeas por dicho retrovirus, y que la expresión de este último podía resultar fuertemente estimulada por los genes inmediatos-tempranos de algunos virus herpes (6).

La totalidad de dichos resultados apunta a la implicación en la EM de por lo menos un retrovirus desconocido o de un virus que presenta actividad de transcriptasa inversa y que resulta detectable según el método publicado por H. Perron (3), calificada de actividad "de RT similar a LM7". El contenido de la publicación identificada por (3) se incorpora a la presente memoria como referencia.

Recientemente, los estudios de los presentes solicitantes han permitido obtener dos líneas celulares continuas infectadas por aislados naturales originados en dos pacientes diferentes que sufrían EM, mediante un método de cultivo según se describe en el documento WO-A-93/20188, cuyo contenido se incorpora a la presente memoria como referencia. Dichas dos líneas, derivadas de células del plexo coroideo humano, denominadas LM7PC y PLI-2, se depositaron en la ECACC el 22 de julio de 1992 y el 8 de enero de 1993, respectivamente, con los números 92072201 y 93010817, según las disposiciones del Tratado de Budapest. Además, los aislados víricos que presentan actividad de RT similar a LM7 también fueron depositados en la ECACC bajo la denominación general de "cepas". La "cepa" o aislado que alberga la línea PLI-2, denominada POL-2, se depositó en la ECACC el 22 de julio de 1992 con el nº V92072202. La "cepa" o aislado albergado por la línea LM7PC, denominada MS7PG, se depositó en la ECACC el 8 de enero de 1993 con el nº V9301816.

Partiendo de los cultivos y aislados indicados anteriormente, caracterizados por criterios biológicos y morfológicos, la etapa siguiente consistió en intentar caracterizar el material de ácidos nucleicos asociado con las partículas víricas producidas en dichos cultivos.

Las porciones del genoma que ya han sido caracterizadas se han utilizado para desarrollar ensayos para la detección molecular de genoma vírico y ensayos inmunoserológicos, utilizando las secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias de nucleótidos del genoma vírico, con el fin de detectar la respuesta inmunológica dirigida contra epítopos asociados a la infección y/o a la expresión vírica.

Dichas herramientas ya han permitido confirmar una asociación entre la EM y la expresión de las secuencias identificadas en las patentes mencionadas a continuación. Sin embargo, el sistema vírico descubierto por el presente solicitante está relacionado con un complejo sistema retrovírico. En efecto, la secuencias que se encuentran encapsidadas en las partículas víricas extracelulares producidas por los diferentes cultivos de células procedentes de pacientes que sufren EM, demuestran claramente que se produce la coencapsidación de genomas retrovíricos que están relacionados pero son diferentes del genoma retrovírico "de tipo salvaje" que produce las partículas víricas infecciosas. Este fenómeno ha sido observado entre retrovirus replicativos y retrovirus endógenos que pertenecen a la misma familia, o incluso retrovirus heterólogos. La idea de retrovirus endógenos resulta muy importante en el contexto del descubrimiento de los presentes inventores debido a que, en el caso de MSRV-1, se ha observado que las secuencias retrovíricas endógenas que comprenden secuencias homólogas al genoma de MSRV-1 existen en ADN humano normal. La existencia de elementos retrovíricos endógenos (ERV) relacionados con MSRV-1 en la totalidad o en parte de su genoma explica el hecho de que la expresión del retrovirus MSRV-1 en células humanas es capaz de interaccionar con secuencias endógenas estrechamente relacionadas. Estas interacciones pueden encontrarse en el caso de retrovirus endógenos patogénicos y/o infecciosos (por ejemplo algunas cepas ecotrópicas del virus de la leucemia murina) y en el caso de retrovirus exógenos cuya secuencia de nucleótidos puede encontrarse parcial o totalmente, en la forma de ERV, en el genoma del animal huésped (por ejemplo el virus de tumor mamario exógeno del ratón transmitido por medio de la leche). Estas interacciones consisten principalmente de: (i) una transactivación o coactivación de ERV por parte del retrovirus replicativo, (ii) y la encapsidación "ilegítima" de ARNs relacionados con ERV o de ERV, (o incluso de ARNs celulares) que simplemente presentan secuencias de encapsidación compatibles, en las partículas retrovíricas producidas mediante la expresión de la cepa replicativa, que en ocasiones son transmisibles y en ocasiones presentan su propia patogenicidad, y (iii) recombinaciones más o menos sustanciales entre los genomas coencapsidados, en particular en las etapas de transcripción inversa, que conducen a la formación de genomas híbridos, que en ocasiones son transmisibles y en ocasiones presentan su propia patogenicidad.

De esta manera,...

1. Fragmento de nucleótidos, que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº 93, SEC ID nº 94, cualquier secuencia de nucleótidos codificante de SEC ID nº 95, el fragmento 19-342 de SEC ID nº 93, cualquier secuencia de nucleótidos codificante del fragmento 7-114 de SEC ID nº 96, cualquier secuencia de nucleótidos codificante de SEC ID nº 97, cualquier secuencia de nucleótidos codificante de SEC ID nº 98, y sus secuencias complementarias, y no comprendiendo ni estando constituido dicho fragmento de nucleótidos por la secuencia HSERV-9.

2. Fragmento de nucleótidos según la reivindicación 1, seleccionado de entre el grupo constituido por SEC ID nº 93, SEC ID nº 94, cualquier secuencia de nucleótidos codificante de SEC ID nº 95, el fragmento 19-342 de SEC ID nº 93, cualquier secuencia de nucleótidos codificante del fragmento 7-114 de SEC ID nº 96, cualquier secuencia de nucleótidos codificante de SEC ID nº 97, cualquier secuencia de nucleótidos codificante de SEC ID nº 98, y sus secuencias complementarias.

3. Sonda de ácidos nucleicos para la detección de un virus asociado a esclerosis múltiple o a artritis reumatoide, caracterizada porque puede hibridarse específicamente con cualquier fragmento según la reivindicación 1 ó 2.

4. Cebador para la amplificación mediante polimerización de un ARN o de un ADN de un material vírico asociado a esclerosis múltiple o a artritis reumatoide, caracterizado porque puede hibridarse específicamente con cualquier fragmento según la reivindicación 1 ó 2.

5. Cebador según la reivindicación 4, que comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº 99 a SEC ID nº 111.

6. Polipéptido codificado por cualquier marco de lectura abierto perteneciente a un fragmento de nucleótidos según la reivindicación 1 ó 2.

7. Polipéptido según la reivindicación 6, caracterizado porque se selecciona de entre el grupo constituido por SEC ID nº 95, SEC ID nº 96, el fragmento 7 a 114 de SEC ID nº 96, SEC ID nº 97 y SEC ID nº 98.

8. Polipéptido antigénico reconocido a partir de los sueros de pacientes infectados con el virus MSRV-1, y/o en los que el virus MSRV-1 ha sido reactivo, caracterizado porque se selecciona de entre cualquier polipéptido según la reivindicación 6 ó 7.

9. Polipéptido según la reivindicación 7, cuya secuencia peptídica se selecciona de entre el grupo constituido por SEC ID nº 173, 174, 175, 180, 181 y 182.

10. Anticuerpo mono- o policlonal dirigido contra el virus MSRV-1, caracterizado porque se obtiene mediante la reacción inmunológica de un cuerpo o células humanos o animales a un agente inmunogénico constituido por un polipéptido antigénico según la reivindicación 8.

11. Reactivo para la detección del virus MSRV-1, o de una exposición a dicho virus, caracterizado porque comprende por lo menos una sustancia reactiva seleccionada de entre el grupo constituido por una sonda o cebador según la reivindicación 3 ó 4; un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9; o un anticuerpo según la reivindicación 10.

12. Composición diagnóstica, profiláctica o terapéutica para la inhibición de la expresión de un virus asociado a esclerosis múltiple o a artritis reumatoide, y/o la actividad enzimática de las proteínas de dicho virus, comprendiendo dicha composición un fragmento de nucleótidos según la reivindicación 1 ó 2.

13. Composición diagnóstica, profiláctica o terapéutica que comprende un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, o un anticuerpo según la reivindicación 10.

14. Procedimiento para la detección in vitro de un virus asociado a esclerosis múltiple o a artritis reumatoide, en una muestra biológica, caracterizado porque un ARN y/o un ADN que se presume pertenece o se origina a partir de dicho virus, o sus ARN y/o ADN complementarios, se ponen en contacto con un fragmento de nucleótidos según la reivindicación 1 ó 2.

15. Procedimiento para la detección in vitro de la presencia o exposición a un virus asociado a esclerosis múltiple o a artritis reumatoide, en una muestra biológica, en el que dicha muestra se pone en contacto con un polipéptido, según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, o un anticuerpo según la reivindicación 10.