Procedimiento de detección de un fragmento nucleico endógeno asociado a una enfermedad autoinmune.
Procedimiento de detección de un fragmento nucleico endógeno que pertenece al gen gag del retrovirus humanoendógeno HERV-W,
en una muestra biológica, que comprende las etapas siguientes:
- extraer el ADN celular de dicha muestra,
- amplificar el ADN extraído con una sonda seleccionada de entre SEC ID nº: 4 a 9 y 12 a 17,
- efectuar una etapa de transcripción/traducción in vitro del producto amplificado,
- hacer reaccionar el producto procedente de la etapa de transcripción/traducción con un suero o un plasma deun paciente que presenta la esclerosis en placas, y
- detectar por lo menos un producto de expresión seleccionado de entre un ARN mensajero cuya traducciónconduce a un polipéptido que consiste en SEC ID nº 31 y un polipéptido que consiste en SEC ID nº 31.
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/FR2000/000144.
Solicitante: BIO MERIEUX.
Nacionalidad solicitante: Francia.
Dirección: CHEMIN DE L''ORME 69280 MARCY L''ETOILE FRANCIA.
Inventor/es: MALLET, FRANCOIS, PARANHOS-BACCALA, GLAUCIA, VOISSET,CÉCILE.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- C07K14/15 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Retroviridae, p. ej. virus de la leucemia bovina, virus de la leucemia felina, virus linfotrópico de células T humanas.
- C12N15/11 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Fragmentos de ADN o de ARN; sus formas modificadas (ADN o ARN no empleado en tecnología de recombinación C07H 21/00).
- C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
PDF original: ES-2388913_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Procedimiento de detección de un fragmento nucleico endógeno asociado a una enfermedad autoinmune.
La presente invención se refiere a un fragmento nucleico endógeno de tipo retroviral integrado al ADN del genoma humano.
Los retrovirus son unos virus de ARN que se replican mediante un proceso denominado de transcripción inversa, mediado por una ADN polimerasa dependiente de ARN denominada reverse transcriptasa (RT) , codificada por el gen pol. El ARN retroviral comprende asimismo por lo menos dos genes adicionales que son los genes gag y env. El gen gag codifica para las proteínas del esqueleto, es decir para la matriz, la cápside y la nucleocápside. El gen env codifica para las proteínas de cubierta. La transcripción se regula mediante unas regiones promotoras situadas a nivel de los LTR (Long Terminal Repeat) que encuadra los extremos 5’ y 3’ terminales del genoma retroviral.
En el curso de la evolución, los humanos o sus ancestros han integrado en su genoma material de origen retroviral tras una infección. En efecto, durante la infección de una célula, la transcriptasa inversa hace una copia de ADN del ARN retroviral, pudiendo entonces esta copia de ADN integrarse eventualmente en el genoma humano. Los retrovirus pueden infectar las células germinales y transmitirse así a las generaciones futuras por transmisión Mendeliana vertical. Se habla entonces de retrovirus endógenos que están presentes en forma de ADN proviral integrado en el genoma de todas las células humanas. La mayoría de los retrovirus endógenos son silenciosos o defectivos. Sin embargo, algunos de ellos han podido conservar la totalidad o parte de sus propiedades iniciales y pueden ser activados en unas condiciones particulares. La expresión de los retrovirus endógenos puede ir desde la transcripción de genes víricos hasta la producción de partículas víricas.
Estos retrovirus endógenos pueden estar asociados directa o indirectamente al desarrollo de ciertas patologías.
Unas estructuras retrovirales endógenas pueden encontrarse en forma completa LTR-gag-pol-env-LTR o en formas truncadas.
Así, en una solicitud anterior de patente (PCT/FR98/01442) , la solicitante ha cribado un banco de ADNc con la ayuda de una sonda Ppol-MSRV (SEC ID nº 18) y ha detectado unos clones solapantes que le han permitido reconstruir un ARN genómico putativo de 7582 nucleótidos. Este ARN genómico presenta una estructura R-U5-gagpol-env-U3-R. Una interrogación “blastn” sobre varias bases de datos con la ayuda del genoma reconstruido ha permitido demostrar que existe una cantidad importante de secuencias genómicas (ADN) parecidas en el genoma humano que se han encontrado sobre varios cromosomas. Así, la solicitante ha demostrado la existencia de estructuras parciales de tipo retroviral en el genoma humano y ha considerado su papel potencial en el desarrollo de enfermedades autoinmunes, en fracasos de embarazo o en estados de embarazo patológicos.
A título de ejemplo, se puede citar como enfermedad autoinmune, la esclerosis en placas, la poliartritis reumatoide, el lupus eritematoso diseminado, la diabetes insulino-dependiente y/o las patologías que les están asociadas.
El aislamiento y la secuenciación de fragmentos de ADNc solapantes y la identificación de clones genómicos (ADN) que corresponden a los clones de ADN aislados, descritos en la solicitud de patente PCT citada anteriormente de la Solicitante se incorporan a la presente memoria a título de referencia.
Aislamiento y secuenciación de fragmentos de ADNc solapantes:
Las informaciones que se refieren a la organización de la nueva familia de retrovirus endógenos denominada por la solicitante HERV-W se obtuvieron ensayando un banco de ADNc placentario (Clontech cat#HL5014a) con las sondas Ppol-MSRV (SEC ID nº 18) y Penv-C15 (SEC ID nº 19) y practicando a continuación una técnica de “gen walking” con la ayuda de las nuevas secuencias obtenidas. Los experimentos se realizaron refiriéndose a las preconizaciones del fabricante del banco. Unas amplificaciones PCR sobre ADN se han utilizado también para comprender esta organización.
Se han seleccionado y secuenciado los clones siguientes:
- Clon c1.6A2 (SEC ID nº 20) : región 5’ no traducida de HERV-W y una parte de gag
- Clon c1.6A1 (SEC ID nº 21) : gag y una parte de pol
- Clon cl.7A16 (SEC ID nº 22) : región 3’ de pol
- Clon cl.Pi22 (SEC ID nº 23) : región 3’ de pol y principio de env
- Clon c1.24.4 (SEC ID n1 24) : ARN empalmado que comprende una parte de la región 5’ no traducida de HERV-W, el final de pol y la región 5’ de env
- Clon cl.C4C5. (SEC ID nº 25) : final de env y región 3’ no traducida de HERV-W
- Clon cl.PH74 (SEC ID nº 26) : ARN sub-genómico: región 5’ no traducida de HERV-W, final de pol, env, y región 3’ no traducida de HERV-W
- Clon cl.PH7 (SEC ID nº 27) : ARN multi-empalmado: región 5’ no traducida de HERV-W, final de env y región 3’ no traducida de HERV-W
- Clon cl.Pi5T (SEC ID nº 28) : gen pol parcial y región U3-R
- Clon c1.44.4 (SEC ID nº 29) : región R-U5, gen gag y gen pol parcial.
Con la ayuda de estos clones, procediendo a unas alineaciones de secuencias, se ha elaborado un modelo de secuencia total de HERV-W. Los ARN empalmados se pusieron en evidencia así como los sitios potenciales donantes y receptores de empalme. Mediante el estudio de la similitud con unos retrovirus existentes, se han definido las entidades LTR, gag, pol y env.
La organización genética putativa de HERV-W en forma ARN es la siguiente (SEC ID nº 30) :
gen 1..7582
Localización de los clones en la secuencia de ARN genómica reconstruida
cl.6A2 (1321 pb) 1-1325 ; cl.PH74 (535+2229= 2764 pb) 72-606 y 5353-7582;
cl.24.4 (491 + 1457= 1948 pb) ; 115-606 y 5353-6810;
cl.44.4 (2372 pb) 115-2496; cl.PH7 (369+297= 666pb) 237-606 y 7017-7313; c1.6A1 (2938 pb) 586-3559.; cl.Pi5T (2785+566= 3351 pb) 2747-5557 y 7017-7582; c1.7A16 (1422 pb) 2908-4337; cl.Pi22 (317+1689 = 2006 pb) 3957-4273 y 4476-6168; c1.C4C5 (1116 pb) 6467-7582
5'LTR 1..120 /nota="R of 5'LTR (extremo 5' inciertao" 121..575 /nota="U5 of 5'LTR"
diverso 579..596 /nota="PBS primer binding site para RNAt-W"
diverso 606 /nota="unión de empalme (sitio donante de empalme ATCCAAAGTG-GTGAGTAATA y sitio receptor de empalme CTTTTTTCAG-ATGGGAAACG clon RG083M05, GenBank accession AC000064) "
diverso 5353 /nota="sitio receptor de empalme para el ORF1 (env) " diverso 5560 /nota="sitio donante de empalme" ORF 5581..7194 /nota="ORF1 env 538 AA" /producto-="cubierta" diverso 7017 /nota="sitio receptor de empalme para ORF2 y ORF3" ORF 7039..7194 /nota="ORF2 52 AA" ORF 7112..7255 /nota="ORF3 48 AA" diverso 7244..7254 /nota="PPT polypurine tract" 3'LTR 7256..7582 /nota="U3-R of 3' LTR (unión U3-R indeterminada) diverso 7563..7569 señal de poliadenilación
Identificación de clones genómicos (ADN) que corresponden a los clones de ADN aislados:
Una interrogación “blastn” sobre varias bases de datos, con la ayuda del genoma reconstruido, ha mostrado que existe una cantidad importante de secuencias parecidas en el genoma humano. Se han identificado
aproximadamente 400 secuencias en GenBank y más de 200 secuencias en el banco EST, la mayoría en antisentido. Las 4 secuencias más significativas en tamaño y en similitud son las secuencias de los clones genómicos (ADN) siguientes:
el clon humano RG083M05 (gb AC000064) cuya localización cromosómica es 7q21-7q22,
el clon humano BAC378 (gb U85196, gb AE000660) que corresponde al locus alfa delta del receptor de las células T, localizado en 14q11-12,
el cósmido humano Q11M15 (gb: AF045450) que corresponde a la región 21q22.3 del cromosoma 21,
el cósmido U134E6 (embl Z83850) sobre el cromosoma Zq22.
Se indica la localización de las regiones alineadas para cada uno de los clones, y la pertenencia a un cromosoma... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Procedimiento de detección de un fragmento nucleico endógeno que pertenece al gen gag del retrovirus humano endógeno HERV-W, en una muestra biológica, que comprende las etapas siguientes:
- extraer el ADN celular de dicha muestra,
- amplificar el ADN extraído con una sonda seleccionada de entre SEC ID nº: 4 a 9 y 12 a 17,
- efectuar una etapa de transcripción/traducción in vitro del producto amplificado, 10
- hacer reaccionar el producto procedente de la etapa de transcripción/traducción con un suero o un plasma de un paciente que presenta la esclerosis en placas, y
- detectar por lo menos un producto de expresión seleccionado de entre un ARN mensajero cuya traducción 15 conduce a un polipéptido que consiste en SEC ID nº 31 y un polipéptido que consiste en SEC ID nº 31.
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