Un anticuerpo purificado, o un fragmento o derivado del mismo,

en el que dicho anticuerpo, o fragmento o derivadodel mismo:

- reconoce y se une al bucle CDR3 de un receptor de antígeno de linfocitos T invariantes (TCR),

- (i) se une y (ii) expande o activa al menos una subpoblación de linfocitos T seleccionada del grupo de: linfocitos T NK,linfocitos T reactivos para CD1d y linfocitos T JαQ+, y

- no reconoce ni se une sustancialmente a otras moléculas;

en el que dicho derivado es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo modificado químicamente, a través de tecnologíade fusión génica, o a través de síntesis química, de modo que esté covalentemente unido a una toxina, compuestoterapéuticamente activo, enzima, citocina, radiomarcador, marcador fluorescente o etiqueta de afinidad.

Composiciones y métodos de anticuerpos monoclonales y policlonales específicos para subpoblaciones de linfocitos T

Antecedentes de la invención

La modulación del sistema inmunitario es deseable para tratar una variedad de enfermedades y trastornos incluyendo, pero sin limitarse a, enfermedades autoinmunitarias, infecciones, alergias, asma, afecciones inflamatorias, aborto espontáneo, embarazo, enfermedad de injerto contra huésped y cánceres.

Los linfocitos T son linfocitos que participan en múltiples reacciones inmunitarias mediadas por células, tales como el reconocimiento y la destrucción de células infectadas o cancerosas. Subgrupos de linfocitos T, tales como linfocitos T supresores, citotóxicos y auxiliares, median en diferentes funciones inmunológicas. Los linfocitos T supresores son los responsables de cortar la respuesta inmunitaria después de que se elimine una infección. Los linfocitos T citolíticos o "citotóxicos naturales" destruyen células infectadas o cancerosas. Los linfocitos T auxiliares producen citocinas que modulan la actividad de los linfocitos T citotóxicos y/o de los linfocitos B productores de anticuerpos.

Un subgrupo de linfocitos T auxiliares, las células Th1, secretan interleucina-1 (IL-1) , IL 2, interferón gamma (TNF-y) , e IL-2 que potencian las respuestas mediadas por células, tales como la actividad de linfocitos T citotóxicos e inhiben tanto la actividad de los linfocitos T auxiliares Th2 como la inmunidad humoral mediada por anticuerpos solubles. Debido a su capacidad para destruir células presentadoras de antígeno y su actividad efectora mediada por citocinas, las células Th1 están asociadas a reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado vigorosas. Se cree que las células Th2, el otro subgrupo de linfocitos T auxiliares, inhiben las respuestas mediadas por células y potencian la respuesta humoral. Las células Th2 secretan IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 e IL-13, que activan el desarrollo de linfocitos B y la producción de anticuerpos. Los linfocitos T también pueden participar en las respuestas de desviación inmunitarias, tales como la supresión de una respuesta inmunitaria en curso que pueda implicar la secreción de TGF-1 o citocinas IL-10 (Sonoda et al, J. Ex. Med. 190:1215-1255, 1999; Streilein et al., Hum. Immunol. 52:138-143, 1997; Hong et al, J. Ex. Med. 190, 1197-1200, 1999; Streilein et al, J. Immunol. 158:3557-3560, 1997) .

Para reconocer un antígeno particular unido a una célula presentadora de antígenos, la mayoría de los linfocitos expresan un receptor de linfocitos altamente específicos (TCR) sobre su superficie celular. Las cadenas de los receptores de linfocitos T más comunes se llaman a y 1. Un segundo receptor de linfocitos T, que se encuentra en una subpoblación menor de linfocitos T, está compuesto por cadenas y y o. Los genes para las cadenas a, 1, y y o de los receptores de linfocitos T tienen organizaciones similares a las de los genes de anticuerpo: existen colecciones de regiones V, D y J a partir de las que se unen los miembros para formar genes enteros.

En contraste con la mayoría de las subpoblaciones de linfocitos T, que tienen diversas secuencias para su cadena TCR-a, los linfocitos T invariantes tienen una cadena TCR-a invariante altamente conservada, Va24-JaQ en seres humanos y Va14-Ja281 en ratones, que se empareja preferencialmente con V111 humana o V18 murina. Estas células son CD4+CD8-o bien CD4-CD8-. Se supone que este TCR invariante permite que los linfocitos T invariantes reconozcan antígenos lípidos derivados de patógenos o endógenos presentados por las proteínas de tipo MHC de clase I no polimórficas, denominadas miembros de la familia CD1. Los seres humanos tienen cuatro proteínas CD1 (CD1a, CD1b, CD1c, y CD1d) , pero los ratones sólo tienen un gen CD1d duplicado que es altamente homólogo a la CD1d humana. La CD1d humana se expresa en niveles altos por los timocitos, en niveles más bajos por linfocitos B y monocitos, por algunas células fuera de los linajes linfático y mieloide.

Muchos linfocitos T invariantes se distinguen por la expresión de varias proteínas de superficie celular halladas en gran medida en los linfocitos citolíticos naturales (NK) , incluyendo CD161 (NKR-P1A) en seres humanos, y una lectina de tipo C de superficie celular, NKR-P1C (NK1) , en ratones. Esa subpoblación de linfocitos T, denominado en el presente documentos como "linfocitos T NK invariantes", representa una fracción principal de los linfocitos T maduros en el timo, la subpoblación principal de linfocitos T en el hígado de ratón, y hasta un 5 % de linfocitos T esplénicos en algunas cepas de ratón.

Los linfocitos T invariantes murinos y humanos producen grandes cantidades de las citocinas inmunorreguladoras IL-4 (un efector de Th2) e IFN-y (un efector de Th1) in vivo en respuesta a un anticuerpo anti-CD3 o CD1d. Estas citocinas permiten que las células participen en ambas respuestas Th2 y Th1. El papel de los linfocitos T invariantes en el aumento de la respuesta de Th2, que parece ser protectora en algunas enfermedades autoinmunitarias, está apoyado además por la presencia de defectos en los linfocitos T invariantes en una serie de modelos humanos y murinos de enfermedades autoinmunitarias, incluidos diabetes de tipo 1. Por tanto, las alteraciones en el equilibrio entre las respuestas Th1 y Th2 inducidas por linfocitos T invariantes pueden desempeñar un papel en el desarrollo de enfermedades autoinmunitarias.

Los linfocitos T invariantes también pueden promover las rápidas respuestas inmunitarias de Th1 y las respuestas antitumorales. Los linfocitos T invariantes, que comprenden una fracción principal de los linfocitos T en el hígado murino, se pueden estimular por IL-12 para llegar a ser linfocitos T citotóxicos activos y proteger contra metástasis hepática en modelos tumorales. Esta conclusión se confirmó genéticamente a través de la generación de ratones inactivados en Ja281, que no expresan el TCR Va14-Ja281 invariante. Estos ratones tenían números notablemente disminuidos de linfocitos T invariantes y no pudieron mediar el rechazo de tumor inducido por IL-12. Otros estudios mostraron que la administración de IL-12 dejó de inducir una respuesta de IFN-y temprana en el bazo e hígado de ratones inactivados en CD1d, que son deficientes en linfocitos T invariantes. Además, los datos de pacientes humanos muestran menores linfocitos T NK invariantes y respuestas de tipo Th1 reducidas en pacientes con cáncer avanzado. La respuesta antitumoral de linfocitos T invariantes activados se pudo mediar parcialmente por su citotoxicidad específica de CD1d y toxicidad de tipo célula NK/LAK. Otras funciones reguladoras de linfocitos T invariantes, posiblemente a través de la producción de citocinas o interacciones con células presentadoras de antígenos (CPA) , también pueden desempeñar papeles importantes en respuestas inmunitarias antitumorales.

Los linfocitos T invariantes también pueden tener un papel en la patogénesis del aborto espontáneo. La estimulación de linfocitos T invariantes deciduales en ratones por administración de un ligando para linfocitos T invariantes provocó aborto en ratones gestantes. Se requirió la destrucción dependiente de perforina y la producción de IFN-y y del factor de necrosis tumoral a por los linfocitos T invariantes para esta inducción de aborto.

En contraste con la sangre periférica humana en la que los linfocitos T invariantes son la subpoblación reactiva de CD1d principal, la médula ósea humana y de ratón y el hígado humano tienen poblaciones de Linfocitos T dominados por linfocitos T no invariantes reactivos para CD1d usando diversos TCR que también pueden producir una gran cantidad de IL-4 y IFN-y. Estos linfocitos T no invariantes reactivos para CD1d pueden ser linfocitos T NK o no NK, y funcionan de forma similar a los linfocitos T invariantes reactivos para CD1d. Los linfocitos T no invariantes reactivos para CD1d en la médula ósea pueden tener un papel en la supresión de la enfermedad de injerto contra huésped, y ambas poblaciones pueden potenciar las respuestas de leucemia contra injerto. En el hígado, estos linfocitos T pueden proteger contra infecciones, tales como infecciones por Hepatitis C, pero también pueden provocar daños debido a su respuesta a Th1.

Además, se descubrió que los linfocitos T NK reactivos para CD1d son decisivos para la tolerancia inmunitaria a antígenos en la cámara anterior del ojo, un sito privilegiado inmunitario (Sonoda et al., supra) . Estos mecanismos también pueden ser importantes en el mantenimiento de la tolerancia periférica.... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo purificado, o un fragmento o derivado del mismo, en el que dicho anticuerpo, o fragmento o derivado del mismo:

- reconoce y se une al bucle CDR3 de un receptor de antígeno de linfocitos T invariantes (TCR) ,

- (i) se une y (ii) expande o activa al menos una subpoblación de linfocitos T seleccionada del grupo de: linfocitos T NK, linfocitos T reactivos para CD1d y linfocitos T JaQ+, y

- no reconoce ni se une sustancialmente a otras moléculas;

en el que dicho derivado es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo modificado químicamente, a través de tecnología de fusión génica, o a través de síntesis química, de modo que esté covalentemente unido a una toxina, compuesto terapéuticamente activo, enzima, citocina, radiomarcador, marcador fluorescente o etiqueta de afinidad.

2. El anticuerpo, o fragmento o derivado del mismo, de la reivindicación 1, en el que dicho bucle CDR3 es un bucle CDR3 humano.

3. El anticuerpo, o fragmento del mismo, de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho anticuerpo, o fragmento o derivado del mismo, se une a linfocitos T NK.

4. Una composición que comprende:

(a) un anticuerpo, o fragmento o derivado del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; y

(b) un transportador farmacéuticamente aceptable.

5. Un anticuerpo bifuncional, o fragmento o derivado del mismo, que comprende:

(a) un primer anticuerpo, o fragmento o derivado del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; en el que dicho primer anticuerpo, o fragmento del mismo se une a un primer epítopo; y

(b) un segundo anticuerpo, o fragmento o derivado del mismo, que se une a un segundo epítopo expresado en un linfocito T que expresa dicho TCR invariante o expresado en un linfocito T NK, un linfocito T reactivo para CD1d, o un linfocito T JaQ+, en el que dicho segundo anticuerpo se une a dicho primer anticuerpo o fragmento o derivado del mismo.

6. Un hibridoma estable que produce un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

7. Un método de generación de un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, comprendiendo dicho método:

(a) acoplar un péptido cíclico que comprende una secuencia correspondiente al menos a una región del bucle CDR3 de un TCR invariante a un transportador;

(b) inmunizar un mamífero no humano con dicho péptido acoplado; y

(c) aislar un anticuerpo que se une a un bucle CDR3 de un TCR invariante y que se une a y expande o activa al menos una subpoblación de linfocitos T seleccionada del grupo de: linfocitos T NK, linfocitos T reactivos para CD1d y linfocitos T JaQ+.

8. El método de la reivindicación 7, en el que dicho péptido cíclico tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 60 % idéntica a una región de SEQ ID N.º: 1 que es al menos de 10 aminoácidos consecutivos.

9. Un método de generación de un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, comprendiendo dicho método:

(a) inmunizar un mamífero no humano deficiente de CD1 o linfocitos T invariantes con linfocitos T invariantes; y

(b) aislar un anticuerpo que se une a un bucle CDR3 de un TCR invariante y que se une y expande o activa al menos una subpoblación de linfocitos T seleccionada del grupo de: linfocitos T NK, linfocitos T reactivos para CD1d y linfocitos T JaQ+.

10. El método de las reivindicaciones 5, 7 ó 9, en el que dicho mamífero no humano es un ratón inactivado para CD1d, un mamífero no humano tolerante a linfocitos T NK, un mamífero no humano tolerante a linfocitos T reactivos para

CD1d, un mamífero no humano tolerante a linfocitos T JaQ+, un mamífero no humano tolerante a TCR invariantes, un mamífero no humano en el que se han retirado los linfocitos T invariantes, un mamífero no humano que carece de parte de la cadena a de dicha cadena a de TCR o un mamífero no humano que carece de parte de la cadena 1 de dicho TCR.

11. Un método de visualización o de medida de la cantidad de TCR NK o del número de linfocitos T NK en una muestra, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha muestra con un anticuerpo, o fragmento o derivado del mismo, de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3.

12. Un método de visualización o de medida de la cantidad de TCR reactivos para CD1d o de la cantidad de linfocitos T reactivos para CD1d en una muestra, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha muestra con un anticuerpo, o fragmento o derivado del mismo, de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3.

13. Un método de visualización o de medida de la cantidad de TCR JaQ+ o de la cantidad de linfocitos T JaQ+ en una muestra, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha muestra con un anticuerpo, o fragmento o derivado del mismo, de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que dicho anticuerpo, o fragmento o derivado del mismo, comprende además un marcador fluorescente, radiomarcador o etiqueta detectable magnética.

15. Un método de incremento del tamaño de una subpoblación de linfocitos T, comprendiendo dicho método poner en contacto una muestra que comprende dichos linfocitos T con un anticuerpo, o fragmento o derivado del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dichos linfocitos T expresan un TCR invariante que tiene un bucle CDR3; y en el que dicha subpoblación de linfocitos T se une por dicho anticuerpo en el que dicho contacto se produce bajo condiciones que dan como resultado un incremento en el número de dichos linfocitos T en dicha subpoblación de linfocitos T.

16. El método de la reivindicación 15, que comprende además poner en contacto dicha muestra con un antígeno y células presentadoras de antígeno bajo condiciones que permitan dicho contacto para incrementar el número de dichos linfocitos T; en el que dicho antígeno es a-galactosilceramida.

17. El método de la reivindicación 15, que comprende además poner en contacto dicha muestra con un antígeno y células presentadoras de antígeno bajo condiciones que permitan dicho contacto para incrementar el número de dichos linfocitos T; en el que dicho antígeno no es a-galactosilceramida.

18. El método de la reivindicación 16 ó 17, en el que dicho antígeno es un antígeno de lípidos o glucosil-fosfatidilinositol de un patógeno infeccioso, un antígeno de una célula cancerosa o un propio lípido.

19. Un método de incremento del tamaño de una subpoblación de linfocitos T, comprendiendo dicho método:

(a) poner en contacto un muestra que comprende dichos linfocitos T con un anticuerpo, o fragmento o derivado del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, llevando a cabo dicho contacto bajo condiciones que permitan la formación de complejos entre dichos linfocitos T y dicho anticuerpo, o fragmento o derivado del mismo;

(b) aislar dicho complejo; y

(c) poner en contacto dichos linfocitos T en dicho complejo o linfocitos T recuperados de dicho complejo con un antígeno y células presentadoras de antígenos bajo condiciones que permitan dicho contacto para incrementar el número de dichos linfocitos T.

20. El método de la reivindicación 19, que comprende además poner en contacto dichos linfocitos T de la etapa (c) con un anticuerpo, o fragmento o derivado del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, bajo condiciones que permitan un incremento en el número de dichos linfocitos T.

21. El método de la reivindicación 19, que comprende además poner en contacto dichos linfocitos T de la etapa (c) con una citocina seleccionada del grupo que consiste en: IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IFN-a/1, IFN-y y GM-CSF.

22. El método de la reivindicación 19, en el que dicho antígeno es a-galactosilceramida.

23. El método de la reivindicación 19, en el que dicho antígeno no es a-galactosilceramida.

24. El método de la reivindicación 19, en el que dicho antígeno es un antígeno de lípidos o glucosil-fosfatidilinositol de un patógeno infeccioso, un antígeno de una célula cancerosa o un propio lípido.

25. Un método de purificación de una subpoblación de linfocitos T de una muestra, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha muestra con un anticuerpo, o fragmento o derivado del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; en el que se usa dicho contacto para purificar dicha subpoblación de linfocitos T de dicha muestra.

26. El método de la reivindicación 25, que comprende además poner en contacto dicha muestra con un anticuerpo anti-Va24, CD4, CD8, CD56, CD161 o V111.

27. El método de la reivindicación 25, en el que dicho anticuerpo, o fragmento o derivado del mismo, está unido covalentemente a un marcador fluorescente, en el que dicho complejo se aísla en base a la señal de fluorescencia de dicho complejo.

28. El método de la reivindicación 25, en el que dicho anticuerpo, o fragmento o derivado del mismo, está unido covalentemente a un marcador magnético, en el que dicho complejo se aísla en base al magnetismo de dicho complejo.

29. El método de la reivindicación 15 ó 19, que comprende además poner en contacto dicha muestra con una citocina seleccionada del grupo que consiste en: IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IFN-a/1, IFN-y y GM-CSF.

30. El método de la reivindicación 29, en el que dicha citocina altera la proporción de respuestas de desviación inmunitaria/Th1/Th2/ por dichos linfocitos T.

31. El método de la reivindicación 15, 19 ó 25, en el que dicho contacto da como resultado una modulación de la actividad de dicha al menos una subpoblación de linfocitos T, en el que dicha actividad se selecciona del grupo que consiste en: producción de citocinas, secreción de quimiocinas, incremento en el tamaño de la subpoblación de linfocitos T y expresión de proteínas coestimuladoras de superficie celular.

32. El método de la reivindicación 31, en el que dicha actividad de dichos linfocitos T se mide después de poner en contacto dichos linfocitos T con un antígeno o células presentadoras de antígenos.

33. Un anticuerpo, o fragmento o derivado del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso en un método de tratamiento o prevención de una enfermedad autoinmunitaria, infección vírica, infección bacteriana, infección parasitaria, infección por un patógeno eucariota, alergia, asma, afección inflamatoria, enfermedad de injerto contra huésped, rechazo de injerto, enfermedad de inmunodeficiencia, aborto espontáneo, embarazo, o cáncer en un mamífero.

34. El anticuerpo, o fragmento o derivado del mismo, para su uso de acuerdo con la reivindicación 33, en el que la administración del anticuerpo, o fragmento o derivado del mismo, da como resultado una modulación del número de linfocitos T en dicha al menos una subpoblación de linfocitos T.

35. El anticuerpo, o fragmento o derivado del mismo, para su uso de acuerdo con la reivindicación 33, en el que la administración del anticuerpo, o fragmento o derivado del mismo, da como resultado una modulación de la actividad de dicha al menos una subpoblación de linfocitos T, en el que dicha actividad se selecciona del grupo que consiste en producción de citocinas, secreción de quimiocinas, incremento en el tamaño de la subpoblación de linfocitos T y expresión de proteínas coestimuladoras de superficie celular.

36. El anticuerpo, o fragmento o derivado del mismo, para su uso de acuerdo con la reivindicación 34 ó 35, en el que dicha administración modula el número o la actividad de dichos linfocitos T después de la activación por un antígeno o células presentadoras de antígeno.

37. Un método de diagnóstico de un sujeto con una afección o un riesgo incrementado por una afección seleccionada del grupo que consiste en enfermedad autoinmunitaria, infección vírica, infección bacteriana, infección parasitaria, infección por un patógeno eucariota, alergia, asma, afección inflamatoria, enfermedad de injerto contra huésped, rechazo de injerto, enfermedad de inmunodeficiencia, aborto espontáneo, embarazo y cáncer; comprendiendo dicho método:

(a) poner en contacto una muestra de dicho sujeto con un anticuerpo, o fragmento o derivado del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3;

(b) cuantificar la cantidad de dicho anticuerpo, o fragmento o derivado del mismo, unido a dicho TCR invariante o dichos linfocitos T; determinando de este modo la cantidad de linfocitos T de interés en dicha muestra; y

(c) comparar la cantidad de dichos linfocitos T de interés en dicha muestra con la cantidad de dichos linfocitos T de intereses hallados en sujetos diagnosticados con dicha afección o en sujetos no diagnosticados con dicha afección.

38. El método de la reivindicación 37, que comprende además: (d) comparar el número de un tipo de linfocitos T diferente de los linfocitos T de interés de la etapa (c) en dicha muestra con el número de dicho tipo de linfocitos T hallado en sujetos diagnosticados con dicha afección o en sujetos no diagnosticados con dicha afección.

Figuras 26A y 26B