Bacteria invasiva que comprende un vector procariótico que comprende una o más moléculas de ADN codificantes de uno o más ARNip,

un promotor procariótico, por lo menos un gen HlyA y por lo menos un locus lnv, en el que dicha bacteria invasiva es E. coli

ANTECEDENTES [0001] El silenciamiento génico mediante ARNip (interferencia del ARN) mediante la utilización de ARNs interfirientes pequeños (ARNip) se ha convertido en una potente herramienta para la biología molecular y presenta el potencial de ser utilizado para el silenciamiento génico terapéutico. También se ha demostrado que horquillas cortas de ARN (ARNhc) transcrito a partir de plásmidos pequeños de ADN dentro de la célula diana median en el silenciamiento génico estable y consiguen la inactivación génica a niveles comparables a los obtenidos mediante transfección con ARNip sintetizado químicamente (T.R. Brummelkamp, R. Bernards, R. Agami, Science 296:550, 2002; P.J. Paddison, A.A. Caudiy, G.J. Hannon, PNAS 99:1443, 2002). [0002] Las posibles aplicaciones para el ARNi con fines terapéuticos son amplias y entre ellas se incluye el silenciamiento e inactivación de genes de enfermedad, tales como oncogenes o genes víricos. Un obstáculo importante para el uso terapéutico del ARNi es la administración del ARNip en la célula diana (Zamore P.D., Aronin N., Nature Medicine 9(3):266-8, 2003). De hecho, se ha descrito la administración como el principal obstáculo actual del ARNi (Phillips Sharp, citado por Nature news feature, vol. nº 425, páginas 10 a 12, 2003). [0003] Se han descrito dos métodos que pueden utilizarse en modelos de ratón:

(1) La inyección intravenosa hidrodinámica directa de ARNip o de plásmidos codificantes de ARNhc: utilizando este método varios autores han descrito la aplicación de ARNi contra diversas condiciones, por ejemplo la hepatitis B (A.P. McCaffrey et al., Nat. Biotechnol. 21(6):639-44, junio de 2003), la hepatitis fulminante (E. Song, S.K. Lee, J. Wang, N. Ince, J. Min, J. Chen, P. Shankar, J. Lieberman, Nature Medicine 9:347, 2003), xenoinjerto tumoral (Spaenkuch B. et al., JNCl 96(1):862-872, 2004), expresión transgénica hepática (D.L. Lewis, J.E. Hagstrom, A.G. Loomis, J.A. Wolff, H. Hereijer, Nature Genetics 32:107, 2002; D.R. Sorensen DR, M. Leirdal, M. Sioud, JMB 327:761, 2003). Este método utiliza una inyección a alta presión y de volumen elevado (2,5 ml) en la vena de la cola del ratón. El mecanismo de incorporación de ARNip/ADN en las células no está claro pero probablemente se encuentra implicado el daño mecánico a la capa endotelial vascular. Una clara desventaja de este método no es un método que pueda desarrollarse en una aplicación humana debido a que implica una carga de volumen masiva y un mecanismo de acción completamente desconocido.

(2) La inyección directa en el tejido diana (cerebro) de un vector adenovírico codificante de ARNip (H. Xia, Q. Mao, H.L. Paulson, B.L. Davidson, Nat. Biotechnol. 20:1006, 2002). Este método demostró el silenciamiento de la expresión transgénica (GFP) en

los tejidos cerebrales alcanzados por el vector adenovírico. Sin embargo, el área de silenciamiento no pudo predecirse de manera fiable. Este método podría ser desarrollado adicionalmente y podría resultar aplicable a la inyección local, por ejemplo intratumoral. Los vectores víricos han sido utilizados ampliamente con fines de terapia génica, pero una lección aprendida de los experimentos de terapia génica es que la extensión vírica puede resultar impredecible en ocasiones y conducir a efectos secundarios no deseados (Marshall E., Science 286(5448):2244-5, 1999). Resulta necesario un método nuevo para la administración segura y predecible de ARNs interfirientes en mamíferos.

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN [0004] La invención se refiere de manera general a métodos de administración de uno o más ARNip en una célula de mamífero mediante la introducción de una bacteria invasiva en la célula, en los que la bacteria contiene una o más moléculas de ADN codificantes de uno o más ARNip, por lo menos un gen HlyA y por lo menos un locus Inv, en los que dicha bacteria invasiva es E. coli. [0005] Asimismo, la invención se refiere a un método para regular la expresión génica en una célula de mamífero, mediante la introducción de una bacteria invasiva en la célula, en el que la bacteria contiene una o más moléculas de ADN codificantes de uno o más ARNip, por lo menos un gen HlyA y por lo menos un locus Inv, en el que los ARNip expresados interfieren con el ARNm del gen que debe regularse, regulando de esta manera la expresión del gen, en el que dicha bacteria invasiva es E. coli. [0006] En una realización del presente método, el gen es ras o β-catenina. En un aspecto de la presente realización, el gen ras es k-Ras. [0007] En una realización de los métodos anteriormente indicados de la invención, la célula de mamífero es una célula humana. [0008] Asimismo, la invención se refiere a la utilización de la bacteria invasiva según la invención para el tratamiento o prevención del cáncer o de un trastorno de la proliferación celular en un mamífero, mediante la regulación de la expresión de un gen o de varios genes en una célula que es conocido que incrementan la proliferación celular, mediante la introducción de una bacteria en la célula. La bacteria contiene una o más moléculas de ADN codificantes de uno o más ARNip, por lo menos un gen HlyA y por lo menos un locus Inv. [0009] En una realización de dicho uso de la invención, el mamífero es un ser humano. En otra realización de dicho uso, los ARNip expresados interfieren con el ARNm del gen que debe regularse. [0010] En una realización de dicho uso, el gen es ras o β-catenina. En un aspecto de la presente realización, el gen ras es k-Ras. [0011] En otra realización de dicho uso de la invención, la célula es una célula de cáncer de colon o una célula de cáncer pancreático. En un aspecto de la presente realización, la célula de cáncer de colon es una célula SW 480. En otro aspecto de la presente realización, la célula de cáncer pancreático es una célula CAPAN-1. [0012] En una realización de los métodos o usos anteriormente indicados de la invención, la bacteria es no patogénica o no virulenta. En otro aspecto de la presente realización, la bacteria es terapéutica. [0013] En otra realización de los métodos o usos anteriormente indicados de la invención, la molécula o moléculas de ADN codificantes de uno o más ARNip se transcriben dentro de la célula de mamífero. En un aspecto de la presente realización, la molécula o moléculas de AR-Nip se transcriben dentro de las células de mamífero en forma de ARNhc. [0014] En otra realización de los métodos y usos anteriormente indicados de la invención, la molécula o moléculas de ADN codificantes de uno o más ARNip se transcriben dentro de la bacteria. En un aspecto de la presente realización, la molécula o moléculas de ADN contienen un promotor procariótico. Opcionalmente, el promotor procariótico es un promotor de T7. [0015] Asimismo, la invención se refiere a una bacteria invasiva que contiene una o más moléculas de ADN codificantes de uno o más ARNip, por lo menos un gen HlyA y por lo menos un locus Inv, en donde dicha bacteria invasiva es E. coli. [0016] En una realización de la presente invención, la bacteria es una bacteria no patogénica o no virulenta. En otro aspecto de la presente realización, la bacteria es una bacteria terapéutica. [0017] Asimismo, la invención se refiere a un vector procariótico que contiene un ADN codificante de uno o más ARNip y a un promotor procariótico. [0018] En una realización de dicho vector de la invención, el promotor procariótico es un promotor de T7. [0019] A menos que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria presentan el mismo significado entendido comúnmente por el experto ordinario en la materia a la que se refiere la presente invención. Aunque pueden utilizarse métodos y materiales similares o equivalentes a los indicados en la presente invención durante la práctica o en ensayo de la misma, se describen posteriormente métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, la presente memoria, incluyendo definiciones, prevalecerá. Además, los materiales, métodos y ejemplos son meramente ilustrativos y no pretenden ser limitativos. [0020] Otras características y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción detallada siguiente y reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS [0021]

La figura 1A muestra micrografías de la invasión de SL 7207 en células SW 480. La fi

gura 1B muestra el análisis FACS de la inactivación de la expresión de la proteína fluo

rescente verde en células CRL 2583. La figura 1C muestra micrografías que muestran

la pérdida de fluorescencia en células CRL 2583.

La figura 2A muestra transferencias...

1. Bacteria invasiva que comprende un vector procariótico que comprende una o más moléculas de ADN codificantes de uno o más ARNip, un promotor procariótico, por lo menos un gen HlyA y por lo menos un locus lnv, en el que dicha bacteria invasiva es E. coli.

2. Bacteria invasiva según la reivindicación 1, para el uso médico.

3. Bacteria invasiva según la reivindicación 1, para el tratamiento o prevención del cáncer

o de un trastorno de proliferación celular en un mamífero, en la que la expresión de por lo menos un gen en una célula que es conocido que incrementa la proliferación celular se regula mediante la introducción de dicha bacteria invasiva.

4. Bacteria invasiva según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha bacteria invasiva es una bacteria no patogénica, no virulenta o atenuada.

5. Bacteria invasiva según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicha bacteria invasiva es una bacteria terapéutica.

6. Bacteria invasiva según la reivindicación 1, en la que el promotor procariótico es un promotor de T7.

7. Uso de por lo menos una bacteria invasiva según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento o prevención del cáncer o de un trastorno de proliferación celular en un mamífero, en el que la expresión de por lo menos un gen en una célula que es conocido que incrementa la proliferación celular se regula mediante la introducción de dicha bacteria invasiva en dicha célula.

8. Bacteria invasiva según la reivindicación 3 ó uso según la reivindicación 7, en los que dicho mamífero es un ser humano.

9. Bacteria invasiva según la reivindicación 3 ó uso según la reivindicación 7, en los que dicha célula es una célula de colon o una célula pancreática.

10. Bacteria o uso según la reivindicación 9, en los que la célula de colon es una célula SW 480 o en los que la célula pancreática es una célula CAPAN-1.

11. Bacteria invasiva según la reivindicación 3 ó uso según la reivindicación 7, en los que el cáncer es cáncer de colon.

12. Bacteria invasiva según la reivindicación 3 ó uso según la reivindicación 7, en los que el trastorno de proliferación celular es la poliposis adenomatosa coli familiar (FAP).

13. Vector procariótico que comprende por lo menos una molécula de ADN codificante de uno o más ARNip y por lo menos un promotor procariótico, y que comprende además

por lo menos un gen HlyA y por lo menos un locus lnv.

14. Vector procariótico según la reivindicación 13, en el que el promotor procariótico es un promotor de T7.

15. Método de administración de uno o más ARNip en células mamífero, comprendiendo el método introducir en dichas células de mamífero por lo menos una bacteria invasiva que comprende un vector procariótico que comprende una o más moléculas de ADN codificantes de uno o más ARNip, un promotor procariótico, por lo menos un gen HlyA y por lo menos un locus lnv, en los que dicha bacteria invasiva es E. coli, excluyendo los métodos in vivo de tratamiento.

16. Método de regulación de la expresión génica en células de mamífero, comprendiendo el método introducir en dichas células de mamífero por lo menos una bacteria invasiva que comprende un vector procariótico que comprende una o más moléculas de ADN codificantes de uno o más ARNip, un promotor procariotico, por lo menos un gen HlyA y por lo menos un locus lnv, en los que los ARNip expresados interfieren con el ARNm del gen que debe regularse, regulando de esta manera la expresión de dicho gen, en los que dicha bacteria invasiva es E. coli, excluyendo los métodos in vivo de tratamiento.

17. Métodos según la reivindicación 15 ó 16, en el que dicha célula de mamífero es una célula humana.

18. Uso según la reivindicación 7 o método según la reivindicación 15 ó 16, en los que dicho promotor procariótico es un promotor de T7.

19. Uso según la reivindicación 7 o método según la reivindicación 16, en los que dicho gen es ras o β-catenina.

20. Uso o método según la reivindicación 19, en los que dicho gen ras es k-Ras.

21. Composición que comprende la bacteria según la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable.

22. Célula huésped eucariótica que comprende la bacteria según la reivindicación 1, y un portador farmacéuticamente aceptable.