Componente de la bromelaína.

Ananaina o una mezcla de ananaina y comosaina para usar en el tratamiento de un cancer mediante el bloqueo de las rutas de la quinasa MAP en una celula cancerigena.

Componente de la bromelaina La presente invencion se refiere a un componente de la bromelaina. En particular, la invencion se refiere al uso de este componente de la bromelaina en medicina, en particular como un agente anticancerigeno y un agente inmunosupresor. La bromelaina del tallo (bromelaina) es el nombre colectivo para las enzimas proteoliticas que se encuentran en los tejidos de la planta Bromeliaceae. Es una mezcla de diferentes restos derivados del tallo de la planta de la pira (Ananas comosus) . Se sabe que la bromelaina contiene al menos cinco enzimas proteoliticas y tambien enzimas no proteoliticas, que incluyen una fosfatasa acida y una peroxidasa; tambien puede contener actividad de amilasa y celulasa. Ademas se encuentran otros componentes diferentes. La bromelaina se ha usado previamente en el tratamiento de una variedad de afecciones, incluyendo la inflamacion, y en particular se ha usado en el tratamiento de la diarrea. El uso de la bromelaina en el tratamiento de la diarrea infecciosa se describe en el documento WO-A-9301800, donde se sugiere que la bromelaina trabaja destruyendo los receptores intestinales para patogenos por proteolisis, y en el documento WO-A-8801506, que ensera que la bromelaina separa los patogenos de los receptores intestinales. Taussig y col., Planta Medica, 1985, 538-539 y Maurer y col., Planta Medica, 1988, 377-381 sugieren ambos que la bromelaina se puede usar en la inhibicion del crecimiento tumoral. Los documentos US 5.223.406, DE-A4302060 y JP-A-59225122 tambien enseran el uso de la bromelaina en el tratamiento del cancer. El documento US 5.223.406 ensera que la bromelaina es capaz de inducir el factor de necrosis tumoral (TNF) , mientras que el documento DE-A4302060 ensera que la bromelaina puede prevenir la metastasis por la modificacion estructural de la proteina de superficie tumoral CD44. En el documento WO-A-9400147, se describen diferentes experimentos que demuestran que la enzimas proteoliticas y en particular la bromelaina, pueden inhibir la secrecion. La solicitud tambien describe que la bromelaina puede reducir la actividad de union de la toxina y puede inhibir el efecto de secrecion de toxinas tales como la toxina labil al calor (LT) y la toxina del colera (CT) y tambien toxinas como la toxina estable al calor (ST) . Esto es independiente del hecho de que la ST tiene un modo de accion muy diferente de la LT y CT. Estas observaciones se explicaban por el hecho de que un componente de la mezcla de bromelaina, la proteasa de la bromelaina del tallo, parece que puede modular las rutas de nucleotidos ciclicos y esto se discute con mas detalle en el documento WO-A-9500169. Ademas, tambien se ha demostrado que la bromelaina inhibe la secrecion producida por la ruta dependiente del calcio. Los autores de la presente invencion han estudiado la variedad de efectos biologicos de la bromelaina, y en particular, sus efectos en un modelo bien documentado de transduccion intracelular de serales, en concreto la seralizacion por el receptor de linfocitos T (TCR) lCD3 y la produccion de IL-2. El significativo avance en los ultimos aros ha conducido al entendimiento de los sucesos bioquimicos que se producen despues del acoplamiento del TCR (revisado por Cantrell, Annu. Rev. Immunol. 14, 259-274, (1996) ) , y por consiguiente la seralizacion por el TCR proporciona un modelo excelente para la elucidacion de los efectos de compuestos biologicamente activos. La activacion eficaz de los linfocitos T requiere dos serales. La primera seral es generada por el complejo de TCRlCD3 despues de acoplamiento con el peptido antigeno presentado por el complejo principal de histocompatibilidad (MHC) expresado en las celulas presentadoras de antigeno (APC) (Cantrell, 1996) . La segunda, la seral coestimuladora, es generada por la union de los recetores CD28 a los linfocitos T con la familia B7 de ligandos en las APC. Un elemento clave en la ruta de seralizacion implicado en la transduccion de serales iniciadas por el receptor al nucleo, es la familia de las proteinas quinasas activadas por mitogeno (MAPk) . Las mejores estudiadas de estas quinasas son las proteinas quinasas r eguladas por s eral e xtracelular ( ERK) -1 y E RK-2 ( tambien d enominadas p44MAPk y p42MAPk, respectivamente) . Las ERK son serinaltreonina quinasas que son activadas cuando se fosforilan los restos de tirosina y treonina. In vitro, esta activacion se invierte si cualquiera de los restos se desfosforila. Un miembro relativamente recien descubierto de la familia de MAPk son las quinasas NH2-terminales de c-Jun (JNK) que existen como formas de 46 kDa y 55 kDa que tambien requieren la fosforilacion para la activacion. La activacion de la ERK depende de p56Lck y del acoplamiento del complejo TCRlCD3 a p21Ras, con la posterior activacion de la cascada de quinasas Raf-1lMEK1lERK. La act ivacion de JNK tambien requiere p21Ras, asi como serales generadas por el receptor coestimulador CD28 que activa proteinas que se unen a GTP (trifosfato de guanosina) (tales como Rac1 o Cdc42) que inducen la cascada de quinasas PAKlMEKKlSEKlJNK. La ERK activada fosforila Elk-1, que a su vez media la induccion de la actividad de c-fos despues de la fosforilacion de c-jun por JNK. c-fos y c-jun activados se combinan para formar la proteina AP-1 necesaria para la sintesis de la IL-2. Los sucesos anteriores se resumen en la figura 1. Todos los sucesos de seralizacion mencionados antes requieren la fosforilacion de tirosina, puesto que los inhibidores de las proteinas tirosina quinasas (PTK) inhiben muchos sucesos asociados con la estimulacion del TCR, incluyendo la activacion de celulas T y la produccion de IL-2. En el documento WO-A-9600082, se mostraba que la bromelaina podia inhibir la fosforilacion de tirosina y la activacion de ERK-2 en celulas T estimuladas por el TCR, o con ester de forbol mas ionoforo de calcio combinados. Ahora se ha encontrado que asociado con la disminucion de la actividad de la ERK, la bromelaina disminuia la acumulacion de ARNm de IL-2, IL-4 e IFN-y en celulas T estimuladas con ester de forbol y ionoforo, pero no afectaba a la acumulacion de ARNm de citoquinas en las celulas estimuladas por el TCR. Estos datos sugieren la existencia de una ruta independiente de ERK y activada por TCR implicada en la produccion de citoquinas en los linfocitos T.

A partir de la tecnica anterior, esta claro que la bromelaina es una mezcla que tiene una variedad de efectos fisiologicos diferentes. No se han caracterizado todos los componentes de la mezcla de bromelaina, y por lo tanto, excepto la proteasa de la bromelaina del tallo cuya actividad se ha descrito, no esta claro cual de los componentes es responsable de cu ales d e l os di ferentes efectos de l a br omelaina. E sto es, p or su puesto, u na desv entaja importante si la m ezcla de bromelaina se va a a dministrar co mo producto f armaceutico porque mientras un componente de la bromelaina puede tener el efecto deseado, tambien puede haber efectos secundarios indeseados procedentes de la accion de algun otro componente de la mezcla de bromelaina.

Por lo tanto, seria beneficioso si se pudieran aislar los componentes individuales de la bromelaina que dan lugar a las actividades medicinalesparticulares y se pudieran administrar por separado de modo que se disminuyera la posibilidad d e ef ectos secundarios. Se ha i dentificado una f raccion activa d e l a bromelaina br uta qu e es la responsable de su capacidad para inhibir la activacion de la ERK, y por lo tanto bloquear la ruta de la MAP quinasa. Aunque no es una proteina individual, esta fraccion consiste solo en algunos componentes y por lo tanto se reduce mucho la posibilidad de efectos secundarios cuando se administra a pacientes comparado con la bromelaina bruta.

La fraccion designadaCCS, se puede aislar de la mezcla de bromelaina por procedimientos convencionales, por ejemplo por cromatografia. La cromatografia de alto rendimiento (HPLC) es adecuada para este proposito y se puede lograr una separacion particularmente buena de las proteinas de la bromelaina por cromatografia liquida rapida de proteinas (FPLCTM) usando un material de empaquetamiento de la columna tal como S-sefarosa. Como se describira con mas detalle en los ejemplos, en la cromatografia en S-sefarosa usando un gradiente lineal de cloruro sodico de 0 a 0, 8 M en tampon de acetato con 300 ml, la proteina era el ultimo pico doble de la columna.

Un componente de la bromelaina que contiene proteinas que tienen pesos moleculares de aproximadamente 15, 07 kDa, 25, 85 kDa y 27, 45 kDa determinados por SDS-PAGE, tiene puntos isoelectricos de 10, 4 y 10, 45 y se puede obtener por el siguiente procedimiento:

i. se disuelve la bromelaina en tampon de acetato a pH 5, 0;

ii. se separan los componentes de la bromelaina por cromatografia liquida de... [Seguir leyendo]

1. Ananaina o una mezcla de ananaina y comosaina para usar en el tratamiento de un cancer mediante el bloqueo de las rutas de la quinasa MAP en una celula cancerigena.

2. Ananaina o una mezcla de ananaina y comosaina para usar de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el cancer es un cancer solido, un tumor no solido o leucemia.

3. Ananaina o una mezcla de ananaina y comosaina para usar de acuerdo con la reivindicacion 2, en la que el cancer solido es cancer de ovario, colon, pecho, pulmon o melanoma.

4. Ananainao una mezcla de ananainaycomosainaparausar de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, junto con un vehiculo, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptables.

5. Ananaina o una mezcla de ananaina y comosaina para usar de acuerdo con la reivindicacion 4, en una forma adecuada para la administracion enterica, oral, nasal, bucal, topica o anal.

6. Ananaina o una mezcla de ananaina y comosaina para usar de acuerdo con la reivindicacion 5, en una forma adecuada para la administracion oral.

7. Ananaina o una mezcla de ananaina y comosaina para usar de acuerdo con la reivindicacion 4, en una forma adecuada para la administracion parenteral.

8. Ananaina o una mezcla de ananaina y comosaina para usar de acuerdo con la reivindicacion 7, en la que la administracion parenteral se selecciona de administracion intravenosa, subcutanea, intramuscular e intraperitoneal.