Aplicaciones de la proteína muNS y sus derivados.

Los autores de la invención han identificado la región mínima de la proteína muNS de los Orthoreovirus aviares capaz de formar inclusiones.

Asimismo, debido a la capacidad de algunas regiones de la proteína muNS de incorporarse a las inclusiones, también han descrito un método de purificación y un método para la detección de la interacción entre dos polipéptidos.

APLICACIONES DE LA PROTEÍNA muNS Y SUS DERIVADOS

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se relaciona con la identificación de la región mínima de la proteína muNS de los Orthoreovirus aviares capaz de formar inclusiones. Asimismo, la invención se relaciona con un método de purificación y un método para la detección de la interacción entre dos polipéptidos, basado en la capacidad de algunas regiones de la proteína muNS de incorporarse a las inclusiones, junto con un péptido de interés.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los reovirus aviares son miembros del género Orthoreovirus, uno de los 12 géneros de la familia Reoviridae (Attoui et al., 2000, 1. Gen. Virol. 81:1507-15) . Estos virus son importantes patógenos de aves y causan importantes pérdidas económicas en la industria avícola (Jones, 2000. Rev. Sci. Tech. 19: 614-25) . Los reo virus aviares son virus sin envoltura lipídica que se replican en el citoplasma de las células infectadas y poseen un genoma de 10 segmentos de ARN de doble cadena rodeados por una doble cubierta proteica concéntrica de 85 nm de diámetro (Zhang et al., 2005. Virology, 343: 25-35) . Los segmentos genómicos están divididos en tres clases en función de su movilidad electroforética, tres de la clase L (large o grande) , otros tres de la M (medium

o mediana) y cuatro de la S (small o pequeña) (Varela y Benavente, 1994. J. Virol. 68: 6775-7) . Con excepción del segmento SI, que es tricistrónico, todos los demás genes son monocistrónicos (Bodelon et al., 2001. Virology, 290: 181-91) . Los segmentos genómicos se transcriben por medio de una polimerasa dependiente de ARN para producir ARN mensajeros (ARNm) con una secuencia nucleotídica idéntica a la de la cadena positiva del segmento de ARN de doble cadena (Li et al., 1980. Virology, 105: 41-51) . Los ARNm virales ejercen una doble función en las células infectadas: programan la síntesis de proteínas virales en los ribo somas, y sirven como molde para la síntesis de las cadenas negativas de los segmentos genómicos.

El genoma del reo virus aviar codifica al menos 12 proteínas, de las cuales 8 son estructurales (que se incorporan al virión) , y 4 no estructurales, que se expresan en células infectadas, pero no forman parte de los reoviriones maduros (Martínez-Costas et al., 1997. 1. Virol. 71: 59-64) . Las proteínas codificadas por los genes de la clase L se

denominan lambda (A) , las codificadas por los de la clase M, mu () l) y los codificados por los de la clase S, sigma (a) . A las proteínas estructurales de cada clase se les ha asignado un sufijo alfabético (AA, AB, etc.) según su movilidad electroforética. El reovirión contiene al menos 10 proteínas estructurales diferentes, 8 de las cuales (AA, AB, AC, ) lA, ) lB, aA, aB yaC) son productos primarios de traducción de sus rnRNAs, mientras que las otras dos, ) lBN y ) lBC, se originan por procesamiento proteo lítico del precursor ) lB (Varela et al., 1996. 1. Virol. 70: 2974-81) . Además de las proteínas estructurales, los reo virus aviares expresan cuatro proteínas no estructurales. Así, los

genes M3 y S4 expresan dos proteínas no estructurales mayoritarias, denominadas ) lNS y aNS, respectivamente (Varela y Benavente, 1994, citado ad supra) mientras que p10 y p17 están codificadas por los dos primeros cistrones del gen SI (Bodelon et al., 2001, citado ad supra) .

Los reo virus aVIares se replican en inclusiones globulares citoplasmáticas denominadas factorías virales o viroplasmas, las cuales contienen proteínas virales estructurales y no estructurales, sin embargo carecen de membranas y organelas celulares (Touris-Otero et al., 2004; 1. Mol. Biol. 341: 361-74) . La expresión individual de proteínas virales en células transfectadas reveló que la proteína no estructural muNS es la única proteína del reo virus aviar capaz de formar inclusiones cuando se expresa en ausencia de otros factores virales (Touris-Otero et al., 2004; citado ad supra) . Esto, yel hecho de que las inclusiones globulares citoplasmáticas formadas por muNS en células transfectadas son muy similares en apariencia a las factorías virales de células infectadas, sugieren que muNS es el factor viral mínimo requerido para la formación de factorías virales en células infectadas con el reovirus aviar. El análisis de células transfectadas que co-expresan muNS y otras proteínas virales reveló que muNS juega un papel importante en estadios tempranos de la morfogénesis del virus y que el reclutamiento de proteínas del reo virus aviar a las factorías virales es un proceso selectivo y controlado temporalmente (Touris-Otero et al., 2004; citado ad supra) .

Los reo virus de mamífero también se replican en inclusiones globulares citoplasmáticas. De la misma manera que con los reo virus aviares, la proteína muNS no estructural se ha visto implicada en la formación de las inclusiones, así como en el reclutamiento de otros componentes a las inclusiones para posibles implicaciones en la replicación del genoma y en el ensamblaje de las partículas.

A pesar de que las proteínas muNS de reo virus aviar y de mamífero muestran únicamente un 28, 3% de identidad de secuencia, ambas contienen dos regiones en su extremo C-terminal con una alta probabilidad de estructura "coiled-coil". Por otro lado, la proteína de mamífero es 86 aminoácidos más larga y es capaz de hacer más contactos primarios con otras proteínas virales estructurales y no estructurales que la proteína aviar (Broering et al. 2004; 1. Virol. 78: 1882-92) . Aunque las proteínas muNS de todas las cepas de reovirus mamíferos (MRV) producen inclusiones globulares cuando se expresan en células transfectadas, la mayoría de las cepas producen factorías virales con morfología filamentosa durante la infección (Parker et al. 2002; J. Virol. 76:4483-96; Broering et al., 2002 1.Virol. 76: 8285-8297) . El fenotipo filamentoso de las factorías de reo virus de mamífero se ha atribuido a la proteína mu2, debido a su capacidad de asociarse tanto con microtúbulos y con muNS de reo virus mamífero. La expresión de versiones truncadas de muNS de MRV en células transfectadas reveló que el segmento entre los residuos 471-721 es la región más pequeña de muNS necesaria y suficiente para formar inclusiones (Broering et al. 2005; J. Virol. 79: 6194-6206) . Se predice que esta región contiene dos segmentos de secuencias con alta probabilidad de formar estructuras "coiled-coil", que están unidas por una región, precedida por un tramo de aproximadamente 50 residuos y seguido por una cola C-terminal. A pesar de que se ha descrito la región mínima de muNS en MRV capaz de formar inclusiones, en los reo virus aviares no se ha identificado dicha región. En la presente memoria, además de determinar dicha región, se describe qué dominios de muNS son capaces de incorporarse a las inclusiones citoplasmáticas formadas por la proteína entera, para comprobar cuáles de ellos están directamente implicados en la interacción entre monómeros de muNS y así desarrollar un método para la purificación de proteínas, así como un método para detectar la interacción entre polipéptidos.

Existen en la actualidad varios sistemas diseñados para la determinación de la interacción entre proteínas, de los cuales el sistema del doble híbrido es el más popular. Este sistema se basa en la expresión de dos proteínas de fusión: una en la que la proteína X está fusionada al dominio de unión a DNA del factor de transcripción GCN4; y otra en la que la proteína Y está fusionada al dominio de activación de transcripción del mismo factor GCN4. Si X e Y interaccionan, se supone que reconstituyen un GCN4 funcional en la célula que activará la transcripción de un gen reportero. Entre los problemas más obvios de este sistema se incluyen: i) aunque X e Y interaccionen, la arquitectura de dicha interacción muchas veces no permite la reconstrucción de un GCN4 funcional; ii) las fusiones pueden alterar las estructuras de los diferentes dominios de GCN4 o de los dominios de interacción de las proteínas problema.

Recientemente se ha descrito un nuevo sistema que utiliza la formación de inclusiones por la proteína muNS de los reovirus de mamífero como una plataforma para detectar interacciones entre proteínas in vivo en células de mamífero (Miller et al., 2007. Mol Cell Proteomics. 6, 1027-38) y que ha sido adaptado también para usarse en levaduras (Schmitz et al., 2009. Nat Methods; 6, 500-2) . En este sistema, la proteína problema... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido que comprende los aminoácidos 381 a 635 de la proteína muNS de un orthoreovirus aviar o una variante funcionalmente equivalente de dicha región y que presenta la capacidad de formar inclusiones cuando se expresa en una célula, en donde dicho polipéptido no es la proteína muNS del orthoreovirus aviar y en donde dicho polipéptido no comprende los primeros 140 aminoácidos del extremo N-terminal de la proteína muNS del orthoreovirus aviar.

2. Un polinucleótido que codifica el polipéptido de la reivindicación l.

3. Una célula que comprende el polinucleótido según la reivindicación 2 o el polipéptido según la reivindicación l.

4. Una proteína de fusión que comprende:

(i) un primer componente que contiene al menos un polipéptido de interés; y

(ii) un segundo componente seleccionado del grupo de:

un polipéptido que comprende la secuenci.

38. 448 (SEQ ID NO: 2) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar o la secuencia correspondiente de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero (SEQ ID NO:55) o una variante funcionalmente equivalente de cualquiera de las anteriores;

un polipéptido que comprende la secuenci.

44. 477 (SEQ ID NO: 3) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar o la secuencia correspondiente de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero (SEQ ID NO:55) o una variante funcionalmente equivalente de cualquiera de las anteriores;

un polipéptido que comprende la secuenci.

47. 542 (SEQ ID NO: 4) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar o la secuencia correspondiente de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero (SEQ ID NO:55) o una variante funcionalmente equivalente de cualquiera de las anteriores; y

un polipéptido que comprende la secuenci.

53. 605 (SEQ ID NO: 5) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar o la secuencia correspondiente de la

proteína muNS del Orthoreovirus mamífero (SEQ ID NO:55) o una variante

funcionalmente equivalente de cualquiera de las anteriores. en donde el segundo componente no contiene un polipéptido que comprende los aminoácidos de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero correspondientes a la secuenci.

60. 635 (SEQ ID NO: 6) de dicha proteína aviar.

5. Polipéptido o proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 4 que comprende además al menos un componente seleccionado del grupo de un péptido para facilitar su purificación y un péptido de señalización nuclear.

6. Un polinuc1eótido que codifica la proteína de fusión según la reivindicación 4.

7. Una célula que incluye la proteína de fusión según la reivindicación 4 o el polinucleótido según la reivindicación 6.

8. Un kit que comprende:

(i) un primer componente seleccionado del grupo de:

(a) un polinuc1eótido que codifica la proteína muNS de un Orthoreovirus o una variante funcionalmente equivalente;

(b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende los aminoácido.

38. 635 de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar o la secuencia correspondiente de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero (SEQ ID NO:55) o una variante funcionalmente equivalente de cualquiera de las anteriores;

y

(c) una célula que expresa la proteína muNS de un Orthoreovirus o un polipéptido que comprende los aminoácido.

38. 635 de dicha proteína o la secuencia correspondiente de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero (SEQ ID NO:55) o una variante funcionalmente equivalente de cualquiera de las anteriores; y

(ii) un segundo componente seleccionado del grupo de:

(a) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la secuenci.

38. 448 (SEQ ID NO: 2) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar o la

secuencia correspondiente de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero (SEQ

ID NO:55) o una variante funcionalmente equivalente de cualquiera de las

anteriores;

(b) un polinuc1eótido que codifica un polipéptido que comprende la secuenci.

44. 477 (SEQ ID NO: 3) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar o la secuencia correspondiente de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero (SEQ ID NO:55) o una variante funcionalmente equivalente de cualquiera de las anteriores;

(c) un polinuc1eótido que codifica un polipéptido que comprende la secuenci.

47. 542 (SEQ ID NO: 4) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar o la secuencia correspondiente de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero (SEQ ID NO:55) o una variante funcionalmente equivalente de cualquiera de las anteriores; y

(d) un polinuc1eótido que codifica un polipéptido que comprende la secuenci.

53. 605 (SEQ ID NO: 5) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar o la secuencia correspondiente de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero (SEQ ID NO:55) o una variante funcionalmente equivalente de cualquiera de las anteriores.

9. Kit según la reivindicación 8 que comprende una célula adecuada para poner en práctica el kit.

10. Uso de una proteína de fusión según la reivindicación 4 para la preparación de un medicamento para la estimulación de la respuesta inmune de un sujeto.

11. Uso de una proteína de fusión que comprende:

(i) un primer componente que contiene al menos un polipéptido de interés; y

(ii) un segundo componente seleccionado del grupo de:

un polipéptido que comprende la secuenci.

38. 448 (SEQ ID NO: 2) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar o la secuencia correspondiente de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero (SEQ ID NO:55) o una variante funcionalmente equivalente de cualquiera de las anteriores;

un polipéptido que comprende la secuenci.

44. 477 (SEQ ID NO: 3) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar o la secuencia correspondiente de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero (SEO ID NO :55) o una variante funcionalmente equivalente de cualquiera de las anteriores;

un polipéptido que comprende la secuenci.

47. 542 (SEO ID NO: 4) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar o la secuencia correspondiente de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero (SEO ID NO:55) o una variante funcionalmente equivalente de cualquiera de las anteriores; y

un polipéptido que comprende la secuenci.

53. 605 (SEQ ID NO: 5) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar o la secuencia correspondiente de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero (SEO ID NO :55) o una variante funcionalmente equivalente de cualquiera de las anteriores;

para incorporar el primer componente a las inclusiones resultantes de la expresión en una célula del polipéptido que comprende los aminoácidos 381 a 635 de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar o los correspondientes del Orthoreovirus de mamífero (SEO ID NO :55) o la proteína muNS completa del Orthoreovirus aviar o de mamífero o una variante funcionalmente equivalente de cualquiera de las anteriores.

12. Uso según la reivindicación 11 en donde si el segundo componente de la proteína de fusión comprende los aminoácido.

38. 448 (SEO ID NO: 2) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar o los correspondientes del Orthoreovirus de mamífero (SEO ID NO:55) , entonces las inclusiones son las resultantes de la proteína muNS completa del Orthoreovirus aviar o de mamífero o una variante funcionalmente equivalente de cualquiera de las anteriores.

13 . Método de purificación de las inclusiones formadas por un polipéptido seleccionado del grupo: polipéptido que comprende los aminoácido.

38. 635 de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar, los aminoácidos correspondientes de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero (SEO ID NO:55) , la proteína muNS completa del Orthoreovirus aviar o de mamífero y una variante funcionalmente equivalente de cualquiera de las anteriores que comprende:

(a) expresar en una célula dicho polipéptido y mantener dicha célula en condiciones adecuadas para la formación de inclusiones; y

(b) purificar dichas las inclusiones.

14. Método de purificación de un polipéptido que comprende una proteína de interés que comprende:

(a) expresar en una célula el polipéptido que comprende los aminoácidos 381635 de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar o los aminoácidos correspondientes de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero (SEQ ID NO:55) o la proteína muNS completa del Orthoreovirus aviar o de mamífero, o una variante funcionalmente equivalente de cualquiera de las anteriores y mantener dicha célula en condiciones adecuadas para la formación de inclusiones;

(b) expresar en dicha célula una proteína de fusión que comprende:

(i) un primer componente que contiene al menos un polipéptido de interés; y

(ii) un segundo componente seleccionado del grupo de:

un polipéptido que comprende la secuenci.

38. 448 (SEQ ID NO: 2) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar o la secuencia correspondiente de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero (SEQ ID NO:55) o una variante funcionalmente equivalente de cualquiera de las anteriores;

un polipéptido que comprende la secuenci.

44. 477 (SEQ ID NO: 3) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar o la secuencia correspondiente de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero (SEQ ID NO:55) o una variante funcionalmente equivalente de cualquiera de las anteriores;

un polipéptido que comprende la secuenci.

47. 542 (SEQ ID NO: 4) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar o la secuencia correspondiente de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero (SEQ ID NO:55) o una variante funcionalmente equivalente de cualquiera de las anteriores; y

un polipéptido que comprende la secuenci.

53. 605 (SEQ ID NO: 5) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar o la secuencia correspondiente de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero (SEQ ID NO:55) o una variante funcionalmente equivalente de cualquiera de las anteriores.

en condiciones adecuadas para que se produzca interacción entre las inclusiones

generadas en la etapa (a) y el segundo componente de la proteína de fusión;

yen donde las etapas (a) y (b) se llevan a cabo en cualquier orden, (c) purificar el complejo formado entre las inclusiones y la proteína de fusión; y (d) separar la proteína de fusión de las inclusiones.

15. Método según la reivindicación 14, en donde si el segundo componente de la proteína de fusión comprende los aminoácido.

38. 448 (SEQ ID NO: 2) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar o los correspondientes del Orthoreovirus de mamífero (SEQ ID NO:55) , entonces las inclusiones expresadas en la etapa (a) son las resultantes de la proteína muNS completa del Orthoreovirus aviar o de mamífero o una variante funcionalmente equivalente de cualquiera de las anteriores.

16. Método para la detección de la interacción entre un primer polipéptido y un segundo polipéptido que comprende:

(a) expresar en una célula el polipéptido seleccionado del grupo: polipéptido que comprende los aminoácido.

38. 635 de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar, los aminoácidos correspondientes de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero (SEQ ID NO:55) , la proteína muNS completa del Orthoreovirus aviar, de mamífero y una variante funcionalmente equivalente de cualquiera de las anteriores y mantener dicha célula en condiciones adecuadas para la formación de inclusiones;

(b) expresar en dicha célula una proteína de fusión que comprende:

(i) un primer componente que contiene el primer polipéptido; y

(ii) un segundo componente seleccionado del grupo de: -un polipéptido que comprende la secuenci.

38. 448 (SEQ ID NO: 2) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar o la secuencia correspondiente de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero (SEQ ID NO:55) o una variante funcionalmente equivalente de cualquiera de las anteriores; -un polipéptido que comprende la secuenci.

44. 477 (SEQ ID NO: 3) de la proteína muNS del Orthoreovirus aviar o la secuencia correspondiente

de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero (SEQ ID NO:55) o una

variante funcionalmente equivalente de cualquiera de las anteriores;

- un polipéptido que comprende la secuenci.

47. 542 (SEQ ID NO: 4) de

la proteína muNS del Orthoreovirus aviar o la secuencia correspondiente

de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero (SEQ ID NO:55) o una

variante funcionalmente equivalente de cualquiera de las anteriores; y

- un polipéptido que comprende la secuenci.

53. 605 (SEQ ID NO: 5) de

la proteína muNS del Orthoreovirus aviar o la secuencia correspondiente

de la proteína muNS del Orthoreovirus mamífero (SEQ ID NO:55) o una

variante funcionalmente equivalente de cualquiera de las anteriores.

en condiciones adecuadas para que la proteína de fusión se dirija a las inclusiones

expresadas en la etapa (a) ;

(c) expresar en dicha célula el segundo polipéptido o bien mantener dicha célula en condiciones adecuadas para que se exprese dicho segundo polipéptido y

(d) determinar si el segundo polipéptido se encuentra asociado al complejo formado por las inclusiones generadas en la etapa (a) y la proteína de fusión expresada en la etapa (b) , en donde si se detecta el segundo polipéptido es indicativo de la interacción entre dicho primer y segundo polipéptido.

en donde las etapas (a) , (b) y (c) se llevan a cabo en cualquier orden

17. Método según la reivindicación 16 en donde el polipéptido que se expresa en la célula de la etapa (a) comprende un péptido para facilitar su purificación o un péptido de señalización nuclear.

18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 16 ó 17, en donde la proteína de fusión incluida en la célula de la etapa (b) y/o el segundo polipéptido incluido en la célula de la etapa (c) comprenden un péptido para facilitar su purificación o un péptido de señalización nuclear.

19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 17 ó 18, en donde la etapa (d) se lleva a cabo mediante la determinación de la aparición del segundo polipéptido en inclusiones nucleares.