Anticuerpo quimérico o humanizado de integrina anti-α5ß1,

que comprende:

- una región de cadena pesada variable con una secuencia seleccionada de entre el grupo consistente en las SEQ ID NOs: 25, 28, y 31 según se define respectivamente en las figuras 10, 11, y 13; y

- una región de cadena ligera variable con una secuencia seleccionada de entre el grupo consistente en las SEQ ID NOs: 26 y 32, según se definen en las figuras 10 y 13, respectivamente

Anticuerpos quiméricos y humanizados de integrina alfa 5 beta 1 que modulan la angiogénesis

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona anticuerpos quiméricos y humanizados que reconocen específicamente la integrina α5β1, así como procedimientos de utilización de los anticuerpos para reducir o inhibir la angiogénesis en un tejido. También se proporcionan procedimientos para la determinación de dosis terapéuticamente aceptables de los anticuerpos y composiciones farmacéuticas que los incluyen.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La angiogénesis es el proceso mediante el cual se crean nuevos vasos sanguíneos. La angiogénesis, también denominada neovascularización, suele acontecer durante la embriogénesis y el desarrollo, y se produce en organismos plenamente desarrollados durante la curación de las heridas y el desarrollo placentario. La angiogénesis también tiene lugar en diversas condiciones patológicas, incluyendo: enfermedades oculares, tales como la retinopatía diabética y la degeneración macular causada por neovascularización; enfermedades asociadas a la inflamación de los tejidos, como la artritis reumatoide y la enfermedad inflamatoria intestinal; y el cáncer, cuando la formación de vasos sanguíneos en los tumores en crecimiento aporta oxígeno y nutrientes a las células tumorales, además de facilitar una ruta a través de la cual se puede propagar por todo el cuerpo la metástasis de las células tumorales. Teniendo en cuenta que son millones las personas que en el mundo se ven afectadas por estas enfermedades, se han realizado considerables esfuerzos por comprender los mecanismos que participan en el angiogénesis, con el fin de desarrollar procedimientos para detectar e inhibir dicha angiogénesis no deseada.

La angiogénesis se produce en respuesta a los estímulos de uno o más factores de crecimiento conocidos, pudiendo también implicar a otros factores no identificados. Las células endoteliales, que son las células con las que se encuentran revestidos los vasos sanguíneos maduros, no suelen proliferar. Sin embargo, en respuesta a un estímulo apropiado, las células endoteliales se activan y comienzan a proliferar y a emigrar hacia tejidos no vascularizados, para formar nuevos vasos sanguíneos. En ciertos casos, las células madre se activan para diferenciarse en células endoteliales, que forman nuevos vasos sanguíneos.

Los vasos sanguíneos se encuentran rodeados por una matriz extracelular. Además de los estímulos provocados por los factores de crecimiento, la angiogénesis depende de la interacción de las células endoteliales con la matriz extracelular, así como de la interacción consigo mismas. La activación de las células endoteliales motivada por factores de crecimiento, y la emigración hacia, y la interacción con la matriz extracelular y con ellas mismas depende de los receptores de la superficie celular expresados por las células endoteliales. Estos receptores de la superficie celular, que incluyen receptores del factor de crecimiento e integrinas, interactúan específicamente con moléculas concretas.

En condiciones patológicas, tales como la degeneración macular provocada por la edad y la retinopatía diabética, la menor disponibilidad de oxígeno en la retina tiene como consecuencia una condición de hipoxia que estimula la secreción de factores de crecimiento angiogénicos, tales como los factores de crecimiento endotelial vascular (VEGF) . Esta secreción induce una migración y una proliferación anormales de células endoteliales en los tejidos oculares. Esto tiene como resultado una vascularización de los tejidos oculares, pudiendo dar lugar a cicatrización corneal, desprendimiento de retina y acumulación de líquidos en la coroides, que pueden afectar negativamente a la visión y provocar la ceguera.

La angiogénesis también se asocia al avance y la exacerbación de enfermedades inflamatorias, incluyendo soriasis, artritis reumatoide, osteoartritis y enfermedades intestinales inflamatorias, tales como la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn. Por ejemplo, en el caso de la artritis inflamatoria, el aflujo de linfocitos al área que rodea las articulaciones estimula la angiogénesis en el revestimiento sinovial. Este aumento de la vasculatura proporciona un medio para que se produzca un mayor aflujo de linfocitos, lo que facilita la destrucción del cartílago y el hueso en la articulación. La vascularización angiogénica que se produce en la enfermedad intestinal inflamatoria tiene como resultado un efecto similar en el vientre.

El crecimiento de los capilares para formar placas arteroescleróticas en las arterias coronarias representa otra condición patológica asociada a la angiogénesis inducida por el factor de crecimiento. Un exceso de flujo sanguíneo en las placas neovascularizadas puede provocar su rotura, así como hemorragias de las placas llenas de sangre, al liberar los coágulos sanguíneos, lo que puede provocar trombosis coronaria.

El papel de la angiogénesis en enfermedades tan diversas como el cáncer, las enfermedades oculares y las enfermedades inflamatorias ha hecho que se intentase identificar procedimientos para inhibir específicamente la angiogénesis como medio para el tratamiento de estas enfermedades. En el caso de los pacientes de cáncer estos procedimientos de tratamiento pueden aportar ventajas sustanciales en comparación con los procedimientos actualmente utilizados, tales como la quimioterapia, que no sólo matarán o inutilizarán las células tumorales objetivo, sino también las células de proliferación normal del paciente, tales como las células sanguíneas, las células epiteliales, y las células que revisten el lumen intestinal. Dichas muertes indiscriminadas por parte de los agentes quimioterapéuticos tienen como resultado una serie de efectos secundarios que, en el mejor de los casos, resultan incómodos, y que con frecuencia pueden conllevar una inaceptable morbilidad o mortalidad de los pacientes. De hecho, los efectos secundarios no deseados asociados a las terapias contra el cáncer suelen limitar el tratamiento que pueden recibir los pacientes. El documento US 2002/172675 describe un anticuerpo monoclonal murino de integrina alfa 5 humana.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona anticuerpos quiméricos y humanizados de uso terapéutico dirigidos contra la integrina α5β1; procedimientos para la purificación de dichos anticuerpos, y procedimientos para su utilización en unas condiciones de tratamiento que comprenden una angiogénesis de los tejidos no deseable.

En una realización, la invención incluye un ácido nucleico que codifica un polipéptido de un anticuerpo quimérico o humanizado de integrina anti-α5β1, que comprende más de las secuencias de aminoácidos seleccionados de entre el grupo con los números de identificación de secuencia (SEQ ID NOS) : 25-26, 28, 31-32. Más preferiblemente, el ácido nucleico codifica un polipéptido de un anticuerpo quimérico o humanizado de integrina anti-α5β1, que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada de entre el grupo consistente en las SEQ ID NOS: 25-26, 28, 31-32. El péptido codificado por este ácido nucleico puede ser un anticuerpo de cadena sencilla o Fab, además de un Fab o anticuerpo que comprende diversos péptidos unidos mediante enlaces de disulfuro.

La invención incluye también un polipéptido que comprende una o más de las secuencias de aminoácidos seleccionadas de entre el grupo consistente en las SEQ ID NOS: 25-26, 28, 31-32. Más preferiblemente, el ácido nucleico codifica un polipéptido que comprende una o más de las secuencias de aminoácidos seleccionadas de entre el grupo consistente en las SEQ ID NOS: 25-26, 28, 31-32. Estos péptidos incluyen anticuerpos quiméricos, humanos y humanizados, y fragmentos Fab.

En una realización preferida, la invención incluye un anticuerpo quimérico de integrina anti-α5β1 que comprende la secuencia de aminoácido de cadena pesada SEQ ID NO: 25 y la secuencia de aminoácido de cadena ligera SEQ ID NO: 26.

En una realización preferida adicional, la invención incluye un fragmento Fab obtenido a partir del anticuerpo quimérico de integrina anti-α5β1 que comprende la secuencia de aminoácido de cadena pesada SEQ ID NO: 25 y la secuencia de aminoácido de cadena ligera SEQ ID NO: 26. En una realización especialmente preferida, el fragmento Fab comprende la secuencia de aminoácido... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo quimérico o humanizado de integrina anti-α5β1, que comprende:

- una región de cadena pesada variable con una secuencia seleccionada de entre el grupo consistente en las SEQ ID NOs: 25, 28, y 31 según se define respectivamente en las figuras 10, 11, y 13; y

- una región de cadena ligera variable con una secuencia seleccionada de entre el grupo consistente en las SEQ ID NOs: 26 y 32, según se definen en las figuras 10 y 13, respectivamente.

2. Anticuerpo quimérico o humanizado de integrina anti-α5β1 conforme a la reivindicación 1, donde la región de cadena pesada variable comprende la SEQ ID NO: 25 según se define en la figura 10 y la región de cadena ligera variable comprende la SEQ ID NO: 26 según se define en la figura 10.

3. Anticuerpo quimérico o humanizado de integrina anti-α5β1 conforme a la reivindicación 1, donde la región de cadena pesada variable comprende la SEQ ID NO: 28 según se define en la figura 11 y la región de cadena ligera variable comprende la SEQ ID NO: 26 según se define en la figura 10.

4. Anticuerpo quimérico o humanizado de integrina anti-α5β1 conforme a la reivindicación 1, donde la región de cadena pesada variable comprende la SEQ ID NO: 31 según se define en la figura 13 y la región de cadena ligera variable comprende la SEQ ID NO: 32 según se define en la figura 13.

5. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la integrina anti-α5β1 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Composición farmacéutica según la reivindicación 5 para su utilización en el tratamiento de la neovascularización coroidal, la retinopatía diabética, la artritis reumatoide y los tumores neoplásicos.

7. Composición farmacéutica según la reivindicación 6, para las utilizaciones indicadas en la reivindicación 6, donde el tumor neoplásico se selecciona entre el grupo formado por los tumores benignos y los tumores malignos.

8. Composición farmacéutica según la reivindicación 7 para las utilizaciones indicadas en la reivindicación 7, donde el tumor benigno se selecciona de entre el grupo formado por el hemangioma, el glioma y el teratoma.

9. Composición farmacéutica según la reivindicación 7 para las utilizaciones indicadas en la reivindicación 7, donde el tumor maligno se selecciona de entre el grupo formado por el carcinoma, el sarcoma, el glioblastoma, el astrocitoma, el neuroblastoma y el retinoblastoma.

10. Composición farmacéutica según las reivindicaciones 6 y 7 para las utilizaciones indicadas en las reivindicaciones 6 y 7, donde la composición ha de administrarse mediante inyección intravenosa.

11. Composición farmacéutica según la reivindicación 6 para su utilización en el tratamiento de la neovascularización coroidal y la retinopatía diabética, donde la composición ha de administrarse mediante inyección intravítrea.

12. Composición farmacéutica según la reivindicación 5 para su utilización en el tratamiento de la neovascularización coroidal de la mácula del ojo.

13. Ácido nucleico que codifica un polipéptido que codifica las secuencias de aminoácidos de cadenas ligera y pesada del anticuerpo quimérico o humanizado de integrina anti-α5β1 conforme a la reivindicación 1, comprendiendo dicho polipéptido secuencias de aminoácidos seleccionadas de entre el grupo consistente en las SEQ ID NOs: 25, 26, 28, 31 y 32, donde el polipéptido comprende las SEQ ID NOs: 26 y 28, SEQ ID NOs: 25 y 26 o SEQ ID NOs: 31 y 32, donde las SEQ ID NOs: 25 y 26 se definen en la figura 10, la SEQ ID NO: 28 se define en la figura 11, y las SEQ ID NOs: 31 y 32 se definen respectivamente en la figura 13.

14. Vector de expresión que comprende los ácidos nucleicos que codifican las regiones de cadena pesada y ligera del anticuerpo quimérico o humanizado de integrina anti-α5β1 conforme a la reivindicación 1, donde las secuencias se seleccionan entre los grupos consistentes en las SEQ ID NOs: 23, 24, 27, 29 y 30, y las SEQ ID NOs: 23 y 24 como se definen en la figura 9, la SEQ ID NO: 27 como se define en la figura 11, y las SEQ ID NOs: 29 y 30 como se definen en la figura 12, respectivamente.

15. Célula transformada mediante el vector de expresión conforme a la reivindicación 14.

Figura 1

Figura 2

A: Secuencias IIA1 VH

B: Secuencias IIA1 VL

Figura 3 A: Secuencias del anticuerp.

20. 4 VH

B: Secuencias del anticuerp.

20. 4 VL

Figura 4 A: Secuencias del M200 VH

B: Secuencias del M200 VL

Figura 5 Figura 6 Figura 7 Figura 8

SECUENCIA COMPLETA DEL ADN DE CADENA PESADA DEL M200 (SEQ ID NO.: 23)

SECUENCIA COMPLETA DEL ADN DE CADENA LIGERA DEL M200 (SEQ ID NO.: 24)

Figura 9

SECUENCIA COMPLETA DEL AMINOÁCIDO DE CADENA PESADA DEL M200 (SEQ ID NO.: 25)

SECUENCIA COMPLETA DEL AMINOÁCIDO DE CADENA LIGERA DEL M200 (SEQ ID NO.: 26)

Figura10

SECUENCIA COMPLETA DEL ADN DE CADENA PESADA DEL F200 (SEQ ID NO.: 27)

SECUENCIA SECUENCIA COMPLETA DEL AMINOÁCIDO DE CADENA PESADA DEL F200 (SEQ ID NO.: 28)

Figura 11

SECUENCIA COMPLETA DEL ADN DE CADENA PESADA DEL huM200 (SEQ ID NO.: 29)

SECUENCIA COMPLETA DEL ADN DE CADENA LIGERA DEL huM200 (SEQ ID NO.: 30)

Figura 12

SECUENCIA COMPLETA DEL AMINOÁCIDO DE CADENA PESADA DEL huM200 (SEQ ID NO.: 31)

SECUENCIA COMPLETA DEL AMINOÁCIDO DE CADENA LIGERA DEL huM200 (SEQ ID NO.: 32)

Figura 13

Definido: VEGF únicamente

Definido: bFGF únicamente

Definido: VEGF + bFGF

Figura 14

fibronectina poli-L-lisina

A.

Visualización de células positivas de Anexina V por inmunofluorescencia

A.

Cuantificación de células positivas de Anexina V por citometría de flujo

Modelo de angiogénesis in Vitro con células HUVEC

Fluorescenc ia media

Fluorescencia media

Fluorescenc ia media

Tratamientos

Tratamientos

Tratamientos

Control F200Control F200Control F200 (EO.

20. 4Fab) (EO.

20. 4Fab) (EO.

20. 4Fab)

Se añadA.en rTGFα, VEGA y HGF B. Se añade tan sólo VEGF C. Se añade tan sólo HGF

Figura 18

Ensayo Elisa Competitivo 112103 Figura 26

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

La lista de referencias citada por el solicitante lo es solamente para utilidad del lector, no formando parte de los documentos de patente europeos. Aún cuando las referencias han sido cuidadosamente recopiladas, no pueden excluirse errores u omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad a este respecto.

Documentos de patente citado en la descripción

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