Un anticuerpo humano aislado que se une específicamente al TNFα

humano, o una parte de unión al antígeno dedicho anticuerpo, en el que dicho anticuerpo:

(a) reduce la unión del TNFα humano a un receptor del TNFα humano;

(b) comprende una cadena pesada de lgG2 humana;

(c) comprende una cadena ligera kappa humana; y

(d) se une al TNFα humano con:

(i) una KD menor de 2 X 10-10 M;

(ii) una Ka mayor de 0,5 x 106 M-1 S-1; o

(iii) una KD menor de 2 X 10-10 M y una Ka mayor de 0,5 x 106 M-1 S-1.

Anticuerpos humanos que se unen específicamente al TNF alfa

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos humanos que se unen específicamente al TNF alfa.

Antecedentes de la tecnología

La capacidad de clonar y reconstruir loci humanos del tamaño de megabases en los YAC (Yeast Artificial Chromosome, cromosomas artificiales de levaduras) e introducirlos en la línea germinal de ratón proporciona un enfoque poderoso para dilucidar los componentes funcionales de loci muy grandes o toscamente mapeados, así como para generar modelos útiles de enfermedades humanas. Además, la utilización de dicha tecnología para la sustitución de loci de ratón con sus equivalentes humanos proporcionaría una comprensión excepcional de la expresión y regulación de productos génicos humanos durante el desarrollo, de su comunicación con otros sistemas y de su implicación en la inducción y la evolución de enfermedades.

Una aplicación práctica importante de dicha estrategia es la “humanización” del sistema inmune humoral de ratón. La introducción de loci de inmunoglobulinas humanas (Ig) en ratones en los que se han inactivado los genes de Ig endógenos ofrece la oportunidad de estudiar los mecanismos que subyacen a la expresión programada y al ensamblaje de anticuerpos, así como su papel en el desarrollo de células B. Además, dicha estrategia proporcionará una fuente ideal para la producción de anticuerpos monoclonales (Mab) completamente humanos, un hito importante para hacer realidad la promesa de una terapia de anticuerpos en enfermedades humanas. Se espera que los anticuerpos completamente humanos minimicen las respuestas inmunogénicas y alérgicas intrínsecas a Mab de ratón o derivatizados de ratón y, por lo tanto, aumenten la eficacia y la seguridad de los anticuerpos administrados. Puede esperarse que el uso de anticuerpos completamente humanos proporcione una ventaja sustancial en el tratamiento de enfermedades humanas crónicas y recurrentes, tales como inflamación, autoinmunidad y cáncer, que requieren administraciones de anticuerpos repetidas.

Un enfoque con este objetivo consistió en generar por ingeniería genética cepas de ratón deficientes en la producción de anticuerpos de ratón con grandes fragmentos de los loci de Ig humanas, esperando que dichos ratones produjeran un gran repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de anticuerpos de ratón. Los grandes fragmentos de Ig humanas conservarían la muy variable diversidad génica, así como la regulación apropiada de la producción y expresión de anticuerpos. Aprovechando la maquinaria del ratón para la diversificación y selección de anticuerpos y la ausencia de tolerancia inmunológica hacia proteínas humanas, el repertorio de anticuerpos humanos reproducido en estas cepas de ratón produciría anticuerpos de alta afinidad contra cualquier antígeno de interés, incluyendo antígenos humanos. Usando la tecnología de hibridomas, se podrían producir y seleccionar fácilmente Mab humanos específicos de antígeno con la especificidad deseada.

Esta estrategia general se demostró en relación con la generación de las primeras cepas de XenoMouseT, como se publicaron en 1994. Véase Green et al. Nature Genetics 7: 13-21 (1994) . Las cepas de XenoMouseT se generaron por ingeniería genética con fragmentos de configuración de línea germinal de los loci de cadena pesada y de los loci de cadena ligera kappa humanos del tamaño de 250 kb y 190 kb, respectivamente, que contenían las secuencias de las regiones variable y constante del núcleo. Ídem. Los cromosomas artificiales de levaduras (YAC) que contienen Ig humanas demostraron ser compatibles con el sistema del ratón tanto para la reorganización como para la expresión de anticuerpos y eran capaces de sustituir a los genes de Ig de ratón inactivados. Esto se demostró por su capacidad para inducir el desarrollo de células B y para producir un repertorio humano de tipo adulto de anticuerpos completamente humanos y para generar Mab humanos específicos de antígeno. Estos resultados también sugerían que la introducción de mayores partes de los loci de Ig humanas que contenían un mayor número de genes V, elementos reguladores adicionales y regiones constantes de Ig humanas podían recapitular sustancialmente el repertorio completo que es característico de la respuesta humoral humana a la infección y la inmunización.

Dicho enfoque se analiza y se describe adicionalmente en las solicitudes de patente de EEUU de nº de serie 07/466.008, presentada el 12 de enero de 1990, 07/610.515, presentada el 8 de noviembre de 1990, 07/919.297, presentada el 24 de julio de 1992, 07/922.649, presentada el 30 de julio de 1992, 08/031.801, presentada el 15 de marzo de 1993, 08/112.848, presentada el 27 de agosto de 1993, 08/234.145, presentada el 28 de abril de 1994, 08/376.279, presentada el 20 de enero de 1995, 08/430.938, presentada el 27 de abril de 1995, 08/464.584, presentada el 5 de junio de 1995, 08/464.582, presentada el 5 de junio de 1995, 08/463.191, presentada el 5 de junio de 1995, 08/462.837, presentada el 5 de junio de 1995, 08/486.853, presentada el 5 de junio de 1995, 08/486.857, presentada el 5 de junio de 1995, 08/486.859, presentada el 5 de junio de 1995, 08/462.513, presentada el 5 de junio de 1995 y 08/724.752, presentada el 2 de octubre de 1996. Véanse también la patente europea nº EP 0 463 151 B1, concedida y publicada el 12 de junio 1996, la solicitud de patente internacional nº WO 94/02602, publicada el 3 de febrero de 1994, la solicitud de patente internacional nº WO 96/34096, publicada el 31 de octubre de 1996 y la solicitud PCT nº PCT/US96/05928, presentada el 29 de abril de 1996. El documento WO 96/33735 desvela anticuerpos humanos producidos por la administración de un antígeno a un Xenoratón.

En un enfoque alternativo, otros, incluyendo GenPharm International, Inc., han utilizado un enfoque de “minilocus”. En el enfoque de minilocus, se mimetiza un locus de Ig exógeno a través de la inclusión de trozos (genes individuales) del locus de Ig. Por lo tanto, para la inserción en un animal, en una construcción se forman uno o más genes VH, uno o más genes DH, uno o más genes JH, una región constante mu y una segunda región constante (preferiblemente una región constante gamma) . Este enfoque se describe en la patente de EEUU nº 5.545.807 de Surani et al. y en las patentes de EEUU nº 5.545.806 y 5.625.825, ambas de Lonberg y Kay, y en las solicitudes de patente de EEUU de GenPharm International de nº de serie 07/574.748, presentada el 29 de agosto de 1990, 07/575.962, presentada el 31 de agosto de 1990, 07/810.279, presentada el 17 de diciembre de 1991, 07/853.408, presentada el 18 de marzo de 1992, 07/904.068, presentada el 23 de junio de 1992, 07/990.860, presentada el 16 de diciembre de 1992, 08/053.131, presentada el 26 de abril de 1993, 08/096.762, presentada el 22 de julio de 1993, 08/155.301, presentada el 18 de noviembre de 1993, 08/161.739, presentada el 3 de diciembre de 1993, 08/165.699, presentada el 10 de diciembre de 1993, 08/209.741, presentada el 9 de marzo de 1994. Véanse también las solicitudes de patente internacional nº WO 94/25585, publicada el 10 de noviembre de 1994, WO 93/12227, publicada el 24 de junio de 1993, WO 92/22645, publicada el 23 de diciembre de 1992 y WO 92/03918, publicada el 19 de marzo de 1992. Véanse además Taylor et al., 1992, Chen et al., 1993, Tuaillon et al., 1993, Choi et al., 1993, Lonberg et al., (1994) , Taylor et al., (1994) y Tuaillon et al., (1995) .

Los inventores de Surani et al., citada anteriormente y cedida al Medical Research Counsel (el “MRC”) , produjeron un ratón transgénico que poseía un locus de Ig mediante el uso del enfoque del minilocus. Los inventores del trabajo de GenPharm International, citado anteriormente, Lonberg y Kay, siguiendo el ejemplo de los presentes inventores, propusieron la inactivación del locus de Ig de ratón endógeno junto con una duplicación sustancial del trabajo de Surani et al.

Una ventaja del enfoque del minilocus es la rapidez con la que pueden generarse construcciones que incluyan partes del locus de Ig e introducirse en animales. Sin embargo, en igual medida, una desventaja significativa del enfoque de minilocus es que, en teoría, se introduce una diversidad insuficiente a través de la inclusión de un pequeño número de genes V, D y J. De hecho, el trabajo publicado parece apoyar esta preocupación. El desarrollo de células B y la producción de anticuerpos de los animales producidos usando el enfoque del minilocus parecían atrofiados. Por lo tanto, los... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo humano aislado que se une específicamente al TNFa humano, o una parte de unión al antígeno de dicho anticuerpo, en el que dicho anticuerpo:

(a) reduce la unión del TNFa humano a un receptor del TNFa humano;

(b) comprende una cadena pesada de lgG2 humana;

(c) comprende una cadena ligera kappa humana; y

(d) se une al TNFa humano con:

(i) una KD menor de 2 X 10-10 M;

(ii) una Ka mayor de 0, 5 x 106 M-1 S-1; o

(iii) una KD menor de 2 X 10-10 M y una Ka mayor de 0, 5 x 106 M-1 S-1.

2. El anticuerpo o la parte de unión al antígeno de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o la parte de unión al antígeno se une al TNFa con una KD menor de 2 X 10-10 M.

3. El anticuerpo o la parte de unión al antígeno de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o la parte de unión al antígeno se une al TNFa con una Ka mayor de 0, 5 x 106 M-1S-1.

4. El anticuerpo o la parte de unión al antígeno de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el anticuerpo o la parte de unión al antígeno se une al TNFa con una KD de 1, 89-8, 06 X 10-10 M.

5. El anticuerpo o la parte de unión al antígeno de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el anticuerpo o la parte de unión al antígeno se une al TNFa con una KA de 1, 2-5, 3 X 109 M-1.

6. El anticuerpo o la parte de unión al antígeno de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el anticuerpo o la parte de unión al antígeno se une al TNFa con una KA de 1, 2-3, 9 X 109 M-1.

7. El anticuerpo o la parte de unión al antígeno de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o la parte de unión al antígeno se une al TNFa con una KD menor de 2 X 10-10 M y una Ka mayor de 0, 5 x 106 M-1S-1.

8. El anticuerpo o la parte de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3-7, en el que el anticuerpo o la parte de unión al antígeno se une al TNFa con una Ka de 1, 6-2, 9 x 106 M-1 S-1.

9. El anticuerpo o la parte de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3-7, en el que el anticuerpo o la parte de unión al antígeno se une al TNFa con una Ka mayor de 2 x 106 M-1S-1.

10. El anticuerpo o la parte de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el dicho anticuerpo es monoclonal.

11. El uso del anticuerpo o la parte de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en la preparación de un medicamento.

12. El uso del anticuerpo o la parte de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad humana crónica o recurrente, tal como inflamación, autoinmunidad y cáncer.

13. El anticuerpo o la parte de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para su uso como un medicamento.

14. El anticuerpo o la parte de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para su uso en el tratamiento de una enfermedad humana crónica o recurrente tal como inflamación, autoinmunidad y cáncer.

15. Un método in vitro para reducir la unión del TNFa humano a un receptor del TNFa humano que comprende la etapa de poner en contacto el TNFa humano con el anticuerpo o la parte de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

16. Un método para producir el anticuerpo humano aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende las etapas de:

(a) inmunizar un ratón transgénico capaz de expresar un anticuerpo completamente humano contra un antígeno de interés con el TNFa humano: y

(b) aislar el anticuerpo humano.

17. Una célula que exprese anticuerpos derivados de un ratón transgénico inmunizado por el método de acuerdo con la reivindicación 16.

18. La célula que expresa anticuerpos de acuerdo con la reivindicación 17, en el que dicha célula es una célula inmortalizada.

19. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica uno o más polipéptidos seleccionados del grupo que consiste en:

(a) la cadena pesada del anticuerpo humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 110;

(b) la cadena ligera del anticuerpo humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10; y

(c) una parte de unión al antígeno de (a) o (b) .

20. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 19.

21. Una célula hospedadora que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 19 o el vector de acuerdo con la reivindicación 20.

22. La célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 21, en el que la célula hospedadora comprende:

(a) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada del anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10 o una parte de unión al antígeno del mismo; y

(b) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera del anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10 o una parte de unión al antígeno del mismo.

23. Un método para producir el anticuerpo o la parte de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que comprende las etapas de cultivar una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 22 y recuperar el anticuerpo.

Los genes de Ig humanos residen en Locigrandes, complejos Reconstitución del locus de cadena pesadahumana en un YAC sencillo Reconstitución del locus proximal de cadena kappahumana en un YAC sencillo enoMouse Fase II:Cadena kappa humana El YAC de cadena pesada de 1020 kb se integraintacto en el genoma de ratón El YAC de cadena ligera kappa de 800 kb se integraintacto en el genoma de ratón Reconstitución de células Ben sangre de XenoMouse Producción de anticuerpos humanos porXenoMouse II

Análisis del repertorio de transcritos de la cadena pesada humana expresados en cepas de XenoMouse II

Análisis del repertorio de transcritos de la cadena ligera kappa expresados en cepas de XenoMouse II

Diversa utilización de genes VH y VK presentes en XenoMouse II

Alta respuesta de anticuerpos humanosespecíficos de antígeno en XenoMouse Composición de anticuerpos anti-IL-8

Secuencias de la cadena pesadade anticuerpos anti-IL-8

Secuencias de la cadena kappade anticuerpos anti-IL-8

Los anticuerpos anti-IL-8 humana bloquean la unión de IL-8 a neutrófilos humanos Inhibición de la expresión de CD11b en neutrófilos humanos poranticuerpos anti-IL-8

Inhibición del flujo de entrada del Ca+ inducido por IL-8 poranticuerpos anti-IL-8

Inhibición de la quimiotaxis de RB/293 por IL-8

Modelo de conejo de inflamación de la piel inducidapor IL-8 humana Inhibición en conejos de inflamación de la piel inducida por IL-8 por anticuerpos Anti-IL-8

Los anticuerpos se administraron en una sola dosis i.v. a 4 mg/kg

Inhibición de angiogénesis en unmodelo del bosillo corneal en ratas Composición génica de anticuerpos contra EGFR

Secuencias de la cadena pesada de anticuerpos contra EGFR

Bloqueo de la unión del EGF a células A431 por anticuerpos humanos anti-EGFR

Inhibición de la unión del EGF a células SW948 por anticuerpos humanos anti-EGFR

Los anticuerpos humanos anti-EGFR inhiben elcrecimiento de células SW948

Inhibición de la unión a TNF-a a células U937 por anticuerposmonoclonales humanos anti-TNF-a Secuencias de la cadena ligera kappaVk (Jk) de anticuerpos anti-EGFR