VACUNA CONTRA LAWSONIA INTRACELLULARIS.

Secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de membrana externa de Lawsonia intracellularis o una parte de dicha secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento inmunogénico de dicha proteína,

teniendo dicha secuencia de ácido nucleico o dicha parte de la misma una homología de al menos el 70% con la secuencia de ácido nucleico representada en la SEC ID Nº 1

La presente invención se refiere a secuencias de ácido nucleico que codifican nuevas proteínas de Lawsonia intracellularis, a fragmentos de ADN, a moléculas de ADN recombinante y vehículos recombinantes vivos que comprenden estas secuencias, a células huésped que comprenden dichas secuencias de ácido nucleico, fragmentos de ADN, moléculas de ADN recombinante y vehículos recombinantes vivos, a las proteínas codificadas por estas secuencias de nucleótidos, a vacunas para combatir las infecciones producidas por Lawsonia intracellularis y procedimientos para la preparación de las mismas, y a herramientas diagnósticas para la detección de Lawsonia intracellularis.

La enteropatía proliferativa porcina (EPP o EP) ha llegado a ser una enfermedad importante de la industria moderna de cerdos en todo el mundo. La enfermedad afecta del 15 al 50% de las piaras en crecimiento y hasta al 30% de los animales individuales en piaras con un problema establecido. Las pérdidas económicas anuales actuales se han estimado en 5-10 dólares americanos por cerdo afectado en alimento adicional y costes de tiempo en las instalaciones. La EEP es un grupo de afecciones crónicas y agudas de signos clínicos ampliamente diferentes (muerte, animales pálidos y anémicos, diarrea acuosa, de color oscuro o rojo vivo, depresión, apetito reducido y reticencia al movimiento, crecimiento retardado y FCR aumentado). Sin embargo, hay dos características constantes. La primera, un cambio patológico sólo visible en la necropsia, es un engrosamiento de la mucosa del intestino delgado y del colon. La segunda es la existencia de bacterias curvadas pequeñas intracitoplasmáticas en los enterocitos del intestino afectado. Actualmente, se ha establecido que estas bacterias son el agente etiológico de la EEP y se han denominado Lawsonia intracellularis.

Con los años, se ha descubierto que Lawsonia intracellularis afecta casi a todos los animales, incluidos monos, conejos, hurones, hámsters, zorros, caballos y otros animales tan diversos como avestruces y emúes. Lawsonia intracellularis es una bacteria flagelada gram-negativa que sólo se multiplica en enterocitos eucariotas y no se ha descrito en cultivos acelulares. Para persistir y multiplicarse en la célula, Lawsonia intracellularis debe penetrar en células de las criptas en división. La bacteria se asocia con la membrana celular y entra rápidamente en el enterocito mediante una vacuola de entrada. A continuación, ésta se rompe rápidamente (en 3 horas) y las bacterias crecen y se multiplican libremente en el citoplasma Los mecanismos por los cuales las bacterias provocan que células infectadas no logren madurar, continúen experimentando mitosis y formen células crípticas hipoplásicas aún no se conocen.

Los conocimientos actuales sobre la infección por Lawsonia intracellularis, el tratamiento y el control de la enfermedad han estado obstaculizados por el hecho de que Lawsonia intracellularis no puede cultivarse en medios acelulares. Aunque hay informes del éxito de co-cultivos de Lawsonia intracellularis en enterocitos de rata, esto no ha conducido al desarrollo de vacunas para combatir la Lawsonia intracellularis, aunque existe claramente una necesidad de dichas vacunas.

Ahora se ha descubierto, sorprendentemente, que Lawsonia intracellularis produce nuevas proteínas de membrana externa (PME) que, solas o en combinación, son capaces de inducir inmunidad protectora contra Lawsonia intracellularis.

Las nuevas proteínas de membrana externa se denominarán proteína de 19/21 kDa, de 37 kDa y de 50 kDa. La proteína de 19/21 kDa se encuentra en dos formas diferentes, una forma de 19 kDa y una forma de 21 kDa, siendo una proteína una forma modificada de la otra y comprendiendo ambas una secuencia de aminoácidos idéntica.

Las secuencias de aminoácidos de las proteínas de 37 kDa y de 50 kDa se presentan en los identificadores de secuencia SEC ID Nº 2 y 4. Los genes que codifican estas dos proteínas se han secuenciado y sus secuencias de ácido nucleico se muestran en los identificadores de secuencia SEC ID Nº 1 y 3. La proteína de 19/21 kDa está caracterizada por tres secuencias de aminoácidos internas de 7, 12 y 12 aminoácidos, respectivamente. Estas secuencias de aminoácidos se presentan en las SEC ID Nº 5, 6 y 7. La presente invención se refiere a la proteína de 37 kDa. Las otras proteínas conciernen a la técnica anterior.

Se sabe bien en la técnica que muchas secuencias de ácido nucleico diferentes pueden codificar una y la misma proteína. Este fenómeno se conoce habitualmente como oscilación en la segunda y especialmente en la tercera base de cada triplete que codifica un aminoácido. Este fenómeno puede provocar una heterología de aproximadamente el 30% para dos secuencias de ácido nucleico que aún codifican la misma proteína. Fenómeno. Por tanto, dos secuencias de ácido nucleico que tienen una homología de secuencia de aproximadamente el 70% aún pueden codificar la misma proteína.

Por consiguiente, una realización se refiere a secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína de Lawsonia intracellularis y a partes de dicha secuencia de ácido nucleico que codifican un fragmento inmunogénico de dicha proteína, en la que dichas secuencias de ácido nucleico o partes de las mismas tienen un nivel de homología con la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº 1 de al menos un 70%. .

Preferentemente, la secuencia de ácido nucleico que codifica esta proteína de Lawsonia intracellularis o la parte de dicha secuencia de ácido nucleico tiene una homología de al menos 80%, preferentemente de 90%, más preferentemente de 95%, con la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº 1. Todavía más preferido es un nivel de homología del 98% o incluso del 100%.

La divulgación también se refiere a secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína de Lawsonia intracellularis y a partes de dicha secuencia de ácido nucleico que codifican un fragmento inmunogénico de dicha proteína, que tienen un nivel de homología con la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº 3 de al menos un 70%.

Preferentemente, la secuencia de ácido nucleico que codifica esta proteína de Lawsonia intracellularis o la parte de dicha secuencia de ácido nucleico tiene una homología de al menos 80%, preferentemente de 90%, más preferentemente de 95%, con la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº 3. Todavía más preferido es un nivel de homología del 98% o incluso del 100%.

El nivel de homología de los nucleótidos puede determinarse con el programa informático “BLAST 2 SEQUENCES” seleccionando el subprograma: “BLASTN”, que puede encontrarse en www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html

Una referencia para este programa es Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden FEMS Microbiol. Letters 174: 247250 (1999). Los parámetros usados son los parámetros por defecto: Recompensa por una coincidencia: +1. Penalización por un error de coincidencia: -2. Apertura de hueco: 5. Extensión de hueco: 2. Disminución x de hueco:

50.

Dado que la presente descripción divulga secuencias de ácido nucleico que codifican nuevas proteínas de 37 kDa y 50 kDa de Lawsonia intracellularis, ahora es posible, por primera vez, obtener estas proteínas en cantidades suficientes. Esto se puede realizar mediante, por ejemplo, el uso de sistemas de expresión para expresar los genes que codifican las proteínas.

Por tanto, en una realización más preferida, la invención se refiere a fragmentos de ADN que comprenden una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención. Dichos fragmentos de ADN pueden ser, por ejemplo, plásmidos en los que se clona una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención. Dichos fragmentos de ADN son útiles para, por ejemplo, aumentar la cantidad de ADN para uso como un cebador, tal como se describe más adelante.

Un requisito esencial para la expresión de la secuencia de ácido nucleico es un promotor adecuado unido funcionalmente a la secuencia de ácido nucleico, de forma que la secuencia de ácido nucleico esté bajo el control del promotor. Para los expertos en la materia es evidente que la elección de un promotor se extiende a cualquier promotor eucariota, procariota o viral capaz de dirigir la transcripción génica en las células usadas como células huésped para la expresión proteica. Por tanto, una forma todavía más preferida de la presente realización se refiere a una molécula de ADN recombinante que comprende un fragmento de ADN o una secuencia de ácido... [Seguir leyendo]

1. Secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de membrana externa de Lawsonia intracellularis o una parte de dicha secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento inmunogénico de dicha proteína, teniendo dicha secuencia de ácido nucleico o dicha parte de la misma una homología de al menos el 70% con la secuencia de ácido nucleico representada en la SEC ID Nº 1.

2. Secuencia de ácido nucleico o parte de la misma de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por que la secuencia tiene una homología de al menos el 80%, preferentemente del 90%, más preferentemente del 95%, con la secuencia de ácido nucleico representada en la SEC ID Nº 1.

3. El fragmento de ADN que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 1-2.

4. Molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 1-2 o un fragmento de ADN de acuerdo con la reivindicación 3, bajo el control de un promotor funcionalmente unido.

5. Proteína de la membrana externa de Lawsonia intracellularis, comprendiendo dicha proteína una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 70% con la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID Nº 2 o un fragmento inmunogénico de dicha proteína.

6. Proteína de Lawsonia intracellularis de acuerdo con la reivindicación 5, que tiene una homología de secuencia de al menos el 80 %, preferentemente del 90%, más preferentemente una homología del 95%, con la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID Nº 2 o un fragmento inmunogénico de dicha proteína.

7. Proteína de Lawsonia intracellularis de acuerdo con las reivindicaciones 5-6 para uso en una vacuna.

8. Uso de una proteína de Lawsonia intracellularis de acuerdo con las reivindicaciones 5-6 para la fabricación de una vacuna para combatir infecciones por Lawsonia intracellularis.

9. Vacuna para combatir infecciones por Lawsonia intracellularis, caracterizada por que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 1-2, un fragmento de ADN de acuerdo con la reivindicación 3, una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 4 o una proteína de acuerdo con las reivindicaciones 5-6, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

10. Vacuna de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizada por que comprende un adyuvante.

11. Vacuna de acuerdo con la reivindicación 9 ó 10, caracterizada por que comprende un antígeno adicional obtenido de un virus o microorganismo patogénico para los cerdos o información genética que codifica dicho antígeno.

12. Vacuna de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizada por que dicho virus o microorganismo patogénico para los cerdos se selecciona del grupo de virus de la seudorrabia, virus de la gripe porcina, parvovirus porcino, virus de la gastroenteritis transmisible, rotavirus, Escherichia coli, Erysipelo rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella cholerasuis, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Micoplasma hyopneumoniae y Actinobacillus pleuropneumoniae.

13. Vacuna para combatir infecciones por Lawsonia intracellularis, caracterizada por que comprende anticuerpos contra una proteína de acuerdo con las reivindicaciones 5 ó 6.

14. Procedimiento para la preparación de una vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 9-12, comprendiendo dicho procedimiento mezclar una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 1-2, un fragmento de ADN de acuerdo con la reivindicación 3, una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 4 o una proteína de acuerdo con las reivindicaciones 5-6 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

15. Procedimiento para la preparación de una vacuna de acuerdo con la reivindicación 13, comprendiendo dicho procedimiento mezclar dichos anticuerpos y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

16. Ensayo de diagnóstico para la detección de ADN específico de Lawsonia intracellularis mediante PCR o hibridación, caracterizado por que el ensayo comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 1-2 o un fragmento del mismo que tiene una longitud de al menos 12, preferentemente 15, más preferentemente 18, nucleótidos.

17. Ensayo de diagnóstico para la detección de anticuerpos contra Lawsonia intracellularis mediante ELISA o transferencia de Western, caracterizado por que dicho ensayo comprende una proteína o un fragmento de la misma como se define en las reivindicaciones 5-6.

18. Ensayo de diagnóstico para la detección de material antigénico de Lawsonia intracellularis mediante ELISA o transferencia de Western, caracterizado por que dicho ensayo comprende anticuerpos contra una proteína o un fragmento de la misma como se define en las reivindicaciones 5-6.