Mutante del Virus de la Diarrea Viral Bovina para uso en una vacuna.

Una vacuna para la protección del ganado frente a la infección por el Virus de la Diarrea Viral Bovina (BVDV),

caracterizada por que la vacuna comprende un mutante del BVDV, mutante que se basa en una cepa citopatógena (cp) del virus, en la que se suprime toda la secuencia génica de Npro, excepto para la secuencia de codificación para los doce aminoácidos N-terminales de la proteína Npro, y en la que el mutante expresa todas las proteínas estructurales del virus, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Mutante del Virus de la Diarrea Viral Bovina para uso en una vacuna La presente invención se refiere a una vacuna que comprende un mutante de un pestivirus, expresando dicho mutante todas las proteínas estructurales del pestivirus y al uso de dicha vacuna para proteger la vida del ganado frente a la infección con un pestivirus.

Los animales se pueden proteger frente a los pestivirus mediante vacunación, sin embargo, las vacunas vivas inactivas o modificadas convencionales presentan desventajas con respecto a la seguridad así como a la eficacia. Por lo tanto, se deberían desarrollar nuevos tipos de vacunas.

Los pestivirus se pueden dividir en dos biotipos diferentes, virus citopatógenos (cp) y no citopatógenos (ncp) , respectivamente. El virus de la diarrea viral bovina (BVDV) , un miembro del género Pestivirus dentro de la familia Flaviviridae es el agente causal de la diarrea bovina, una enfermedad económicamente importante del ganado vacuno en todo el mundo. Especies de virus muy relacionadas, genética y estructuralmente, son el Virus Clásico de la Peste Porcina (CSFV) y el Virus de la Enfermedad de la Fronteras en ovinos (BDV) . Los pestivirus pueden inducir varias enfermedades con pérdidas económicas notables en todo el mundo. Las principales pérdidas económicas causadas por las infecciones con BVDV son fertilidad reducida, abortos y la generación de terneros infectados persistentemente, que pueden desarrollar la "Enfermedad de las Mucosas" mortal. El genoma del pestivirus consiste en un ARN monocatenario de orientación positiva. El ARN tiene una longitud de aproximadamente 12, 3 kb y contiene una fase de lectura abierta (ORF) grande, que está flanqueada por regiones sin traducir (NTR) en ambos extremos del genoma. La ORF pestiviral se traduce en una poliproteína, que se procesa de forma co-y posttraducción en 12 proteínas maduras mediante proteasas virales y celulares. En NS3 del BVDV cp se expresa de forma más eficaz, por ejemplo, debido a inserciones que permiten una escisión más eficaz de las proteínas NS2 y NS3 no estructurales. Por lo tanto, el BVDV cp se caracteriza por cantidades más elevadas notables de NS3 detectable en cultivos de células infectadas. La primera proteína de la ORF pestiviral es la Npro (proteasa Nterminal) . La Npro es una autoproteasa no estructural que se escinde por sí misma del resto de la poliproteína codificada por la ORF, y de ese modo crea su propio extremo C y además el extremo N correcto para la primera proteína estructural en la ORF, la proteína C (núcleo) . La Npro no tiene equivalentes en otros flavivirus. La proteína C en la ORF va seguida de otras proteínas estructurales: ERNS, E1, E2 (en ese orden) . En conjunto, la proteína de la cápside (C) y las tres proteínas de envoltura glicosiladas (ERNS, E1, E2) constituyen el virión pestiviral. Las proteínas estructurales van seguidas de las proteínas no estructurales (p7, NS2-NS3 y NS3, NS4A, NS4B, NS5A, y NS5B) . La NS3 (serina proteasa) y la NS5 (actividad de polimerasa de ARN dependiente de ARN) están implicadas directamente en la replicación viral.

Los pestivirus se pueden clasificar diferentes formas. Para el BVDV, se pueden distinguir diferentes genotipos (BVDV-1 y BVDV-2) . Además, se pueden distinguir dos biotipos diferentes después de la infección de células cultivadas, denominadas cepas citopáticas (cp) y cepas no citopáticas (ncp) .

Los genotipos se basan en la divergencia en la secuencia del genoma viral. La infección de las células cultivadas con una cepa cp conduce a la lisis de las células, mientras que la infección con una cepa ncp no parece que cause ningún daño celular. Por lo general se cree que las cepas cpBVDV se desarrollan a partir de cepas ncpBVDV mediante la reestructuración del genoma viral. Para BVDV, en aislados de ncp se observa principalmente NS2-NS3 sin procesar, aunque se pueden detectar cantidades bajas de NS3. Por el contrario, en aislados de cp la parte de C terminal de NS2-3 aparece en cantidades más elevadas, la proteína NS3. En CP7 aislado de BVDV, se demostró que una inserción de 27 nucleótidos en la región que codifica a NS2 era suficiente para mediar una escisión de NS2-3 eficaz, y transmitía citopatogenia (Tautz et al., J. Virol., 73 (11) , 94229432, 1999) .

Los biotipos diferentes de BVDV se han asociado con diferentes formas de enfermedad. Además, la infección con BVDV tiene la capacidad de causar una infección persistente (PI) en el feto en desarrollo. Cuando el ganado en estado de gestación, susceptible a la infección, se expone a un BVDV no citopático (entre 42 y 110 días de gestación) puede nacer un ternero infectado de forma persistente (PI) . Los terneros infectados de forma persistente son inmunotolerantes a la cepa del BVDV que infectó al feto. Por lo tanto, los terneros PI son portadores eficaces para toda la vida del virus y son la causa más importante de difusión del virus en el ganado susceptible en todo el mundo. Por lo tanto, este síndrome de PI crea una necesidad de altos niveles de inmunidad hacia BVDV a partir de vacunas para evitar estas infecciones.

Para BVDV, se puede hacer una subdivisión en cepas BVDV-1 y cepas BVDV-2. BVDV-1 y -2 se pueden distinguir entre sí por PCR diferencial o por secuenciación de ácidos nucleicos. Recientemente, los dos genotipos se han subdividido adicionalmente en todos subgenotipos tales como BVDV1a, BVDV1b, BVDV2a y BVDV 2b. Se conocen más de 11 subtipos de BVDV 1.

Los estudios sobre la replicación de pestivirus se han visto facilitas de forma considerable mediante sistemas de genética inversa y el descubrimiento de ARN subgenómicos de replicación de forma autónoma (replicones) . (Behrens et al., J. Virol., 72, 2364-272, 1998; Meyers et al., J. Virol., 70, 8606-8613, 1996) . Los requisitos mínimos para la replicación del CSFV se investigaron, por ejemplo, mediante la creación de genomas del CSFV defectuosos que carecen de las secuencias génicas para las proteínas estructurales. Se encontró que los genomas del CSFV defectuosos aún se replicaban y se podrían empaquetar en partículas virales cuando se introducían en células SK-6 junto con ARN de A187-CAT auxiliar (Moser et al., J. Virol., 7787-7794, 1999) . Se describieron un genoma del BVDV defectuoso de replicación de forma autónoma, que carece de parte de la secuencia génica de Npro así como los genes que codifican C, Erns, E1, E2, p7 y NS2 (Behrens et al., J. Virol., 72, 2364-2372, 1998) . Kupfermann et al., crearon mutantes de BVDV a partir de las cepas SD-1 y CP 13 de BVDV en las que los primeros 12 aminoácidos de Npro se mantenían, pero el resto se suprimía, junto con las proteínas estructurales (excepto para AA 551-560 de la proteína E1) .

Se ha sugerido que la región de codificación 5â? del gen de Npro representa parte de BVDV IRES (Tautz et al., mencionado anteriormente; Behrens et al., mencionado anteriormente; Meyers et al., J. Virol., 75 (9) , 4226-4238, 2001) , y es esencial para la replicación.

La presente invención tiene como objetivo proporcionar nuevos mutantes de pestivirus para uso en vacunas. Una vacuna se dirige principalmente a la provocación de la respuesta inmune. Una vacuna, por otro lado, debería ser capaz de provocar una respuesta inmune protectora, aunque, por otro lado, no debería provocar, por supuesto, de la enfermedad (viral) en el animal o animales de contacto inoculados. La respuesta inmune inducida normalmente se dirige principalmente frente a las proteínas de envoltura del virus. Pero, si se usa un replicón a partir del cual se han suprimido todas las secuencias estructurales, más en particular, todas las secuencias que codifican proteínas de envoltura, dichas proteínas no se producen a partir del replicón y no se obtiene ninguna respuesta inmune a estas proteínas. Los anticuerpos del BVDV se dirigen frente a ERNS, E2 y NS3. La actividad de neutralización se demostró predominantemente para anticuerpos específicos de E2.

Las vacunas se pueden basar en todo el virus, de tipo silvestre, que se ha inactivado (vacunas inactivas) . Además, las vacunas se pueden basar en una proteína del virus en particular, que se puede producir in vitro mediante técnicas de ADN recombinante. Normalmente, dicha proteína será una proteína de envoltura del virus (vacuna subunitaria) . La presente invención se refiere a una tercera categoría de vacunas, vacunas vivas atenuadas, basadas en un mutante viral que provoca una respuesta inmune protectora en el animal huésped, pero que no provoca la enfermedad viral, debido a mutaciones en su genoma.

Los mutantes de pestivirus en los que se suprimió (parte de) un gen estructural se conocen en la técnica. Por ejemplo, en el documento de patente EP1161537, se describen los mutantes del CSFV a partir de los que... [Seguir leyendo]

1. Una vacuna para la protección del ganado frente a la infección por el Virus de la Diarrea Viral Bovina (BVDV) , caracterizada por que la vacuna comprende un mutante del BVDV, mutante que se basa en una cepa citopatógena (cp) del virus, en la que se suprime toda la secuencia génica de Npro, excepto para la secuencia de codificación para los doce aminoácidos N-terminales de la proteína Npro, y en la que el mutante expresa todas las proteínas estructurales del virus, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

2. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por que los doce aminoácidos N-terminales de la 10 proteína Npro son MELITNELLYKT.

3. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el mutante se basa en la cepa CP7 del BVDV.