UNIDAD Y PROCEDIMIENTO PARA REALIZAR FERMENTACIÓN A ALTA DENSIDAD CELULAR.

Una unidad para realizar una fermentación continua, a alta densidad celular,

que contiene un fermentador de precultivo (9), un tanque de almacenamiento de sustrato (1), un fermentador de producción (2), un separador de sedimentación (4) y un recipiente de recogida (6) caracterizado porque el separador de sedimentación tiene un área superficial del separador de Ath/Vs≥30 m 2 /m 3 , basada en el volumen del separador, y el separador de sedimentación tiene una cámara de recepción (32, 44), cónica o piramidal, y el flujo de entrada en la cámara de recepción del separador de sedimentación tiene lugar a través de al menos dos conductos dispuestos radialmente (35), tangencialmente en una dirección idéntica (39, 34) o tangencialmente en direcciones opuestas (41, 42), estando dispuestos los conductos de una manera regular a lo largo de la sección transversal

La presente invención se refiere a un procedimiento continuo para cultivar líneas celulares suspendidas, animales o vegetales, con el objetivo de producir eficazmente productos biológicos. La invención se refiere también a unidades y aparatos en los que puede realizarse el procedimiento de acuerdo con la invención para cultivar líneas celulares suspendidas, animales o vegetales. 5

Los cultivos celulares son altamente importantes para la producción de sustancias biológicamente activas y productos farmacéuticamente activos. En particular, el cultivo de las células, que se usan frecuentemente y se suspenden libremente en el medio nutriente, es difícil y complicado puesto que, en contraste con los microorganismos o células adherentes, son muy sensibles a las tensiones mecánicas y a un suministro insuficiente de sustrato. Por esta razón, las unidades y aparatos de acuerdo con la invención, y los procedimientos técnicos usados, son de crucial 10 importancia para un procedimiento de producción eficaz.

En la mayoría de los procedimientos técnicos para cultivar líneas suspendidas, animales o vegetales, se usan procedimientos discontinuos. Dichos procedimientos tienen la desventaja de que el recuento celular, las concentraciones del medio nutriente, y los metabolitos cambian continuamente a lo largo del ciclo discontinuo de días o semanas, y que las células muertas se acumulan en la última fase de la fermentación y los productos formados 15 experimentan degradación enzimática o espontánea. De esta manera, los procedimientos de fermentación continua son recomendables, particularmente para la producción de compuestos activos inestables.

Los procedimientos continuos son económicos y competitivos si pueden conseguirse altas densidades celulares en el fermentador y, correspondientemente, se obtiene una alta productividad. Esto requiere

(1) un suministro suficiente de oxígeno en el fermentador para cubrir la alta demanda de oxígeno de las células a 20 altas densidades,

(2) un sistema de retención celular que permita una retención eficaz de las células en el sistema de reactor,

(3) un funcionamiento a largo plazo más fiable con respecto a las condiciones de operación estacionarias (concentraciones de célula, sustrato, metabolito y producto) y esterilidad a largo plazo de todo el sistema de reactor y 25

(4) un procedimiento que pueda manejarse de forma robusta, sencilla y fácil.

El procedimiento debería tener en cuenta también la alta sensibilidad de las células hacia la tensión mecánica y el suministro insuficiente de sustrato, y la inestabilidad de los productos.

La técnica anterior describe un gran número de aparatos, unidades y procedimientos para cultivar líneas celulares. Las siguientes variantes de aparatos y unidades ya se conocen: 30

1. Fermentadores

El suministro de oxígeno sin burbujas a través de membranas porosas o de difusión es el procedimiento de suministro de oxígeno seleccionado frecuentemente para los fermentadores de cultivo celular, puesto que la formación, ascensión y explosión de burbujas en la superficie del líquido somete a las células a altos grados de tensión. Los agitadores recomendados para este fin son agitadores relativamente pequeños, de alta velocidad, de transporte axial, 35 que se disponen centralmente en estatores de membrana (por ejemplo, Fenge, Fraune, Maier, 1992. BioTec, 4: 52-54). Dicho diseño de reactor es desventajoso, debido tanto a los agitadores de alta velocidad, de transporte axial, que provocan grados muy altos de tensión como debido al hecho de que tiene lugar una velocidad relativamente baja y, en consecuencia, una baja velocidad de transporte de oxígeno, sobre las membranas localizadas entre la pared del recipiente y el agitador. 40

El diseño de reactor más adecuado es aquel en el que el transporte de oxígeno se intensifica mediante grandes agitadores, dispuestos a una ligera distancia desde y sobre toda la altura de la membranas, aunque debido a los tabiques deflectores usados en este diseño de reactor, únicamente puede usarse un estator de membrana relativamente pequeño y una superficie de transferencia de masa correspondientemente pequeña.

Puesto que cuando el procedimiento se aumenta de escala la proporción entre el área superficial de la 45 membrana y el volumen del reactor cambia de una manera inversamente proporcional al diámetro del reactor, el procedimiento de suministro de oxígeno mencionado anteriormente sólo es adecuado para reactores pequeños o para menores densidades celulares.

También, el suministro de oxígeno mediante una aireación con burbujas grandes y la dispersión de las burbujas mediante agitación limitan la densidad celular y la viabilidad del cultivo celular, debido al gran grado de 50 tensión mecánica implicada.

2. Retención celular

En el pasado, se han propuesto numerosos sistemas de retención celular diferentes, para procedimientos de fermentación continuos, que están dispuestos apropiadamente fuera del fermentador, para permitir una manipulación flexible.

Para minimizar el daño a las células que ocurre cuando se usan aparatos externos, en particular como 5 resultado del suministro insuficiente de oxígeno a las células y la retirada insuficiente de CO2 fuera del fermentador, los sistemas de retención celular con pequeños volúmenes de trabajo y un tiempo de residencia correspondientemente corto de las células en el sistema de retención celular son particularmente deseables.

Además de los filtros de membrana y las unidades de filtración de flujo cruzado con membranas estacionarias y móviles, se han usado centrífugas y aparatos de sedimentación especiales. 10

Cuando la retención celular tiene lugar mediante filtros de membrana, se observan, sin embargo, efectos de ensuciamiento que hacen imposible el funcionamiento a largo plazo, robusto y de bajo mantenimiento de los mismos. Una reducción en el ensuciamiento puede obtenerse mediante una alta velocidad de flujo en las membranas. Puesto que las altas velocidades en las bombas, tuberías y canales de las unidades de membrana, sin embargo, producen un aumento de la tensión, la necesidad de altas velocidades se rechaza por el requisito de un tratamiento de baja cizalla 15 de las células.

Para la retirada de las células mediante centrifugación se han desarrollado centrífugas especiales que tienen la desventaja de someter las células a una tensión mecánica aumentada, puesto que se usan aceleraciones de más de doscientas veces la aceleración gravitatoria para su retirada. Además, las centrífugas no funcionan de forma fiable durante varias semanas o meses sin mantenimiento, y provocan también un aumento de los costes operativos. 20

Un procedimiento adicional de retirada de células de los sobrenadantes de cultivo celular es el uso de unidades de sedimentación gravitatoria. Las unidades de sedimentación gravitatoria usadas predominantemente en el cultivo celular son tanques de sedimentación y sistemas de canales inclinados. Comparados con los recipientes de sedimentación sencillos, los sistemas de canales inclinados tienen la ventaja de un volumen considerablemente menor.

Los sistemas descritos hasta ahora (J. Stevens, u.a.: Preprint Esact-Meeting 1993 Würzburg; K.J. Thompson, 25 J.S. Wilson: Preprint Esact-Meeting 1993 Würzburg; J.A. Searles, u.a. Biotechnol. Prog. 1994,10, 188-206; WO 94/26384) son sistemas contracorriente con áreas de sedimentación muy pequeñas (Ath=z l b1 cos  < 0,2 m2; z: número de placas; b1: anchura; L: longitud de los canales; Α: inclinación respecto a la horizontal) y, por lo tanto, no pueden usarse para producción a escala. El documento US 5 817 505 describe el uso de un separador de sedimentación para separar células de hibridoma del medio que contiene anticuerpos. 30

El aumento de escala es un problema en los sistemas de canales inclinados en contracorriente, puesto que el volumen de concentrado requerido y las cámaras de recogida de fase clarificada del separador de sedimentación, VSF, aumenta superproporcionalmente a medida que aumenta el volumen del fermentador V (VSF  V1,5 a una velocidad de perfusión constante) y aumenta aún más con el aumento de la velocidad de perfusión q/V (VSF  (qN)2,15 a un volumen de fermentador constante). La geometría de la mayoría de los sistemas de canales inclinados propuestos para el 35 cultivo de células, sin embargo,... [Seguir leyendo]

1. Una unidad para realizar una fermentación continua, a alta densidad celular, que contiene un fermentador de pre-cultivo (9), un tanque de almacenamiento de sustrato (1), un fermentador de producción (2), un separador de sedimentación (4) y un recipiente de recogida (6) caracterizado porque el separador de sedimentación tiene un área superficial del separador de Ath/Vs≥30 m2/m3, basada en el volumen del separador, y el separador de sedimentación tiene 5 una cámara de recepción (32, 44), cónica o piramidal, y el flujo de entrada en la cámara de recepción del separador de sedimentación tiene lugar a través de al menos dos conductos dispuestos radialmente (35), tangencialmente en una dirección idéntica (39, 34) o tangencialmente en direcciones opuestas (41, 42), estando dispuestos los conductos de una manera regular a lo largo de la sección transversal.

2. Una unidad para realizar una fermentación continua, a alta densidad celular, de acuerdo con la reivindicación 10 1, caracterizada porque el separador de sedimentación tiene un área superficial del separador de Ath≥0,5 m2 y, al mismo tiempo, un área superficial específica de Ath/Vs ≥ 30 m2/m3 (basada en el volumen del separador) o un área superficial específica de Ath/V ≥ 5 m2/m3 (basada en el volumen del fermentador) mientras que la unidad puede funcionar a velocidades de perfusión en el intervalo de 5 a 15 volúmenes de fermentador por día.

3. Una unidad para realizar una fermentación continua, a alta densidad celular, de acuerdo con la reivindicación 15 1 y 2, caracterizada porque el separador de sedimentación tiene un área superficial del separador de Ath/Vs = 50 - 100 m2/m3, basada en el volumen del separador.

4. Una unidad de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el flujo de entrada en el separador de sedimentación (4) tiene lugar a través de los conductos dispuestos tangencialmente, en una dirección idéntica, en un canal anular (40) localizado fuera de la cámara de recepción. 20

5. Una unidad de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el flujo de entrada (35) en la cámara de recepción del separador de sedimentación (4) tiene lugar a una altura geométrica por encima de la base de la cámara de recepción, que es mayor que la mitad de la altura total de la cámara de recepción, y menor de 0,8 veces, más preferentemente menor de 0,75 veces la altura total de la cámara de recepción.

6. Una unidad de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el separador de 25 sedimentación se hace funcionar de acuerdo con el principio de flujo cruzado.

7. Una unidad de acuerdo con la reivindicación 6, en la que un canal de flujo de entrada adicional transporta el medio de fermentación directamente a la cámara de recepción (33, 44), reduciendo de esta manera el tiempo de retención de las células en dicha cámara de recepción.

8. Una unidad de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1 a 7, en la que las placas o tubos paralelos 30 del separador de sedimentación están dispuestos dentro de un módulo rectangular, cuya proporción de altura de la sección transversal a anchura de la sección transversal corresponde aproximadamente al seno del ángulo  entre la horizontal y el ángulo de inclinación del módulo, en su estado ensamblado.

9. Una unidad de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1 a 8, en la que el flujo de entrada al separador de sedimentación tiene lugar a través de difusores circulares (35), que tienen un ángulo de semi-cono de 35 como máximo 6º, o a través de difusores planos (39) que tienen un diferencial longitudinal del área de la sección transversal dividido por la periferia (1/P dA/ds) de 0,1 o menor, a velocidades de como máximo 0,1 m/s.

10. Una unidad de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1 a 9, en la que dicho separador de sedimentación consiste en un módulo rectangular (29), en el que los canales individuales (31) están separados espacialmente entre sí mediante placas (30), y dichas placas se guían y mantienen en surcos en el módulo, y dichas 40 placas, si fuera necesario, pueden ensamblarse o desensamblarse.

11. Una unidad de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1 a 5 y 8 a 10, en la que los canales rectangulares inclinados o tubos del separador de sedimentación son de 50 cm de longitud o mayores, y las alturas del canal correspondiente son menores de o iguales a 10 mm.

12. Una unidad de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1 a 5 y 8 a 10, en la que los canales 45 rectangulares inclinados o tubos del separador de sedimentación son de 50 cm de longitud o mayores, y las alturas del canal son de 4 a 6 mm.

13. Una unidad de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 6 a 7, en la que el separador de sedimentación de corriente cruzada tiene canales rectangulares inclinados que son de 20 cm de longitud o mayores, y los canales son de 10 mm o menos de altura. 50

14. Una unidad de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 6 a 7, en la que el separador de

sedimentación de corriente cruzada tiene canales rectangulares inclinados que son de 20 cm de longitud o mayores, y las alturas de los canales son de 4 a 6 mm.

15. Una unidad de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1 a 14, en la que las placas o tubos paralelos del separador de sedimentación tienen una rugosidad superficial de menos de Ra = 0,25 m en sus superficies orientadas hacia arriba, o éstas superficies están revestidas hidrófobamente o tienen un acabado superficial 5 con un efecto de flor de loto.

16. Una unidad de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1 a 15, en la que las placas o tubos paralelos del separador de sedimentación pueden someterse a vibraciones de una frecuencia y amplitud específicas.

17. Una unidad de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque el fermentador de pre-cultivo (9) tiene una sección transversal que está ahusada en una dirección descendente, el agitador del fermentador de pre-cultivo 10 (23) está suspendido de una manera excéntrica y la aireación del pre-cultivo se realiza mediante una unidad de aireación de micro-rociado (25).

18. Una unidad de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque se usan un agitador de anclaje (13), de área grande, cerca de la membrana y un sistema de aireación sin burbujas (14), enrollado axialmente, en el fermentador de producción. 15

19. Una unidad de acuerdo con la reivindicación 18, en la que las paletas agitadoras del agitador de anclaje están ahusadas (13a) en el área cercana a la base (13a, 23a).

20. Una unidad de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1 a 19, en la que una unidad de aireación (17) se incorpora adicionalmente para aireación.

21. Una unidad de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque un agitador de paletas (21), de área 20 grande, y tabiques deflectores inclinados (19), que está a una distancia de la pared, de la base del fermentador y de la superficie del líquido, está dispuesto en el fermentador de producción.

22. Una unidad de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque el agitador de paletas (21), de área grande, está dispuesto excéntricamente el fermentador de producción.

23. Una unidad de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1 a 22, en la que un anillo de aireación se 25 incorpora adicionalmente en el fermentador de producción, para el micro-rociado (17).

24. Una unidad de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1 a 23, en la que un hidrociclón (11), o un sistema de separación ultrasónico, está dispuesto aguas arriba del separador de sedimentación (4).

25. Una unidad de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1 a 24, en la que el separador de aglomerado (12) está dispuesto aguas abajo de la salida de reciclado del separador de sedimentación (36, 47). 30

26. Una unidad de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1 a 25, en la que el cambiador de calor de flujo directo (3) está dispuesto, en cada caso, entre la salida del tanque de fermentación y la entrada del separador de sedimentación (34, 45, 48), y entre la salida de concentrado del separador de sedimentación (36, 47) y la entrada de reciclado del tanque de fermentación.

27. Una unidad de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1 a 26, en la que se aplican bombas de baja 35 cizalla (8), que conducen a una tensión de cizalla turbulenta de menos de o igual a 0,1 N/m2.

28. Un procedimiento para realizar una fermentación continua, a alta densidad celular, caracterizado porque se usa una unidad de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1 a 28.

29. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 28, que usa una etapa de pre-cultivo de una sola fase, caracterizado porque el pre-cultivo se realiza, al menos intermitentemente, como un procedimiento de alimentación 40 discontinua, y el volumen de pre-cultivo aumenta, debido a la alimentación discontinua, a al menos 3 a 6 veces su volumen de partida.

30. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 29, en el que el pre-cultivo se realiza, al menos intermitentemente, como un procedimiento continuo con el reciclado celular.

31. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 30, en el que al mismo tiempo que el cultivo de producción, 45 se realiza un pre-cultivo como un procedimiento continuo con el reciclado de las células.