Un dispositivo que mejora la tasa de reproducción (mediante una mayor velocidad de reproduccion y/o rendimiento reproductivo) de células vivas en suspensión o cualesquiera organismos cultivables,

incluyendo bacterias, arqueas, eucariotas y virus mediante un proceso de selección natural, dicho dispositivo incluye:

a) una tubería flexible estéril (1) que contiene un medio de cultivo,

b) un sistema de compuertas (3, 4, 5) logrado con abrazaderas que dividen la tubería en:

- una región aguas arriba que contiene un medio de cultivo fresco (7),

- una cámara de crecimiento (10) que contiene el cultivo situado entre las regiones aguas arriba y aguas abajo,

- y una región aguas abajo que contiene cultivo residual (15),

c) un medio para mover la tubería (1) con respecto a las compuertas (3, 4, 5), de manera que una porción (B) de la cámara de crecimiento y del cultivo asociado puedan soltarse y separarse de la cámara de crecimiento, y de manera que una porción (D) de la tubería fresca que contiene medio sin usar pueda unirse a una porción (C) del cultivo y del medio asociado ya presente en la cámara de crecimiento,

caracterizado porque la tubería (1), el medio y el cultivo dentro de la tubería se mueven mediante el movimiento peristáltico simultáneo de las compuertas.

Aparato de cultivo continuo con recipiente móvil para la selección de variantes de células filtrantes.

Campo de la invención

La invención descrita proporciona un método y un dispositivo que permite la selección de células vivas, con tasas de reproducción mayores y propiedades metabólicas específicas, en un medio líquido o semisólido. Para el proceso de selección (evolución adaptativa) , los organismos genéticamente modificados (mutantes) surgen en una población y compiten con otras variantes del mismo origen. Aquellos con la tasa de reproducción más rápida aumentan en proporción relativa durante el tiempo que conduce a una población (y organismos individuales) con una mayor tasa reproductiva. Este proceso puede mejorar el rendimiento de organismos usados en procesos industriales

o con fines académicos.

Antecedentes de la invención

La selección de una tasa reproductiva mayor (capacidad) requiere un crecimiento sostenible que se consigue mediante la dilución regular de un cultivo en crecimiento. En la técnica anterior esto se conseguía de dos formas: Dilución en serie y cultivo continuo, que difieren principalmente en el grado de dilución.

El cultivo en serie supone la transferencia repetitiva de una pequeña cantidad de un cultivo a un recipiente mucho mayor que contiene un medio de cultivo fresco. El proceso se repite cuando los organismos cultivados hayan crecido hasta saturación en el nuevo recipiente. Este método se ha usado para conseguir las demostraciones más largas de cultivo sostenido en la literatura (Lenski & Travisano: Dynamics of adaptation and diversification: a 10, 000generation experiment with bacterial populations. 1994. Proc Natl Acad Sci USA. 15:6808-14) , en experimentos que claramente probaron ser una mejora consistente en la tasa reproductiva durante un periodo de años. Este proceso normalmente se hace de forma manual, con una considerable inversión en mano de obra y está sujeto a contaminación debido a su exposición al exterior. El cultivo en serie por lo tanto no es eficiente, según se describe en el siguiente párrafo.

La tasa de selección o la tasa de mejora en la tasa reproductiva depende del tamaño de la población (Fisher: The Genetical Theor y of Natural Selection.1930. Oxford University Press, Londres, UK) . Además, en una situación como la transferencia en serie en la que el tamaño de la población fluctúa rápidamente, la selección es proporcionala la media armónica (Ñ) de la población (Wright: Size of population and breeding structure in relation to evolution. 1938. Science 87: 430-431) , y por lo tanto puede calcularse por aproximación por la población más baja durante el ciclo.

El tamaño de la población puede sostenerse y por lo tanto hacer la selección más eficiente mediante cultivo continuo. El cultivo continuo, a diferencia de la dilución en serie, implica un volumen relativamente menor de manera que una pequeña parte del cultivo en crecimiento se reemplaza regularmente por un volumen igual de un medio de cultivo fresco. Este proceso maximiza el tamaño efectivo de la población aumentando su tamaño mínimo durante la dilución cíclica. Los dispositivos que permiten el cultivo continuo se llaman “quimiostatos” si las diluciones tienen lugar en los intervalos de tiempo especificados, y “turbidostatos” si la dilución tiene lugar automáticamente cuando el

cultivo crece a una densidad específica.

En aras de la simplicidad, en adelante se agrupará a ambos tipos de dispositivos bajo el término "quimiostato". Los quimiostatos fueron inventados simultáneamente por dos grupos en los años 50 (Novick & Szilard: Description of the chemostat. 1950. Science 112: 715-716) y (Monod: La technique de la culture continue - Théorie et applications. 1950. Ann. Inst. Pasteur 79:390-410) . Los quimiostatos se han usado para demostrar cortos periodos de mejora rápida en la tasa reproductiva (Dykhuizen DE. Chemostats used for studying natural selection and adaptive evolution. 1993. Methods Enzymol. 224:613-31) .

Los quimiostatos tradicionales no son capaces de mantener largos periodos de selección para una tasa reproductiva mayor debido a la no intencionada selección de variantes resistentes a la dilución (estática) . Estas variantes son capaces de resistir la dilución adhiriéndose a la superficie del quimiostato, y de esta manera, superan a individuos menos pegajosos incluyendo aquellos con tasas reproductivas más altas, obviando así el fin pretendido para el dispositivo (Chao & Ramsdell: The effects of wall populations on coexistence of bacteria in the liquid phase of chemostat cultures. 1985. J. Gen. Microbiol. 131: 1229-36) .

Se ha inventado un método y dispositivo quimiostático (el Motor Genético) para evitar la resistencia a la dilución en cultivo continuo (documento de patente US 6.686.194-B1 solicitado por PASTEUR INSTITUT [FR] & MUTZEL RUPERT [DE]) . Este método usa una transferencia de fluido controlada por una válvula para mover periódicamente el cultivo creciente entre dos quimiostatos permitiendo la esterilización y enjuague de cada uno entre los periodos de crecimiento activo del cultivo. Los ciclos regulares de esterilización previenen la selección de variantes resistentes a la dilución al destruirlas. Este método y dispositivo logran el objetivo pero requieren complejas manipulaciones independientes de varios fluidos en un entorno estéril (sellado) , incluido uno (NaOH) que es muy cáustico y potencialmente muy reactivo, válvulas que se dañan rápidamente, y que plantean problemas de contención y eliminación de residuos.

El documento JP 03.030.665 describe un dispositivo de subcultivo automático para organismos microscópicos o células que incluye un tubo flexible en el que el medio de cultivo está lleno y varias válvulas de bloqueo que pueden apretar o soltar dicho tubo y que se desplazan a lo largo del mismo para crear una nueva cámara de crecimiento.

El documento US 6.066.497 describe un aparato celular que comprende, montada en un rotor, una bomba peristáltica con canales que están conectados a botellas que contienen un cultivo celular. La bomba es capaz de vaciar las botellas gracias a los rodillos de la bomba. Los canales no se mueven.

Resumen de la invención

Es por tanto objeto de la presente invención proporcionar un método mejorado (y completamente independiente) y un dispositivo para cultivo continuo de organismos (que incluye bacterias, arqueas, eucariotas y virus) sin interferencia de variantes resistentes a la dilución. Como otros quimiostatos, el dispositivo proporciona un medio de dilución regular de un cultivo con un medio de cultivo fresco, un medio para intercambio de gas entre el cultivo y el exterior, esterilidad y operación automática como quimiostato o como turbidostato.

La presente invención está diseñada para conseguir este objetivo sin transferencia de fluido, incluyendo las funciones de esterilización y enjuague. Esto representa una ventaja específica de la presente invención con respecto a la técnica anterior en la medida en que evita los riesgos y dificultades asociados con la esterilización y enjuague, incluyendo contención y complejas transferencias de fluido que incluyen solventes cáusticos.

El cultivo continuo se consigue dentro de un tubo estéril flexible lleno de un medio de cultivo. La superficie del medio y de la cámara son estáticas entre sí y ambas se reemplazan regular y simultáneamente por el movimiento

peristáltico de la tubería a través de las “puertas” o puntos en los que el tubo está estérilmente subdividido por

abrazaderas que previenen que los organismos cultivados se muevan entre regiones del tubo. Para mayor seguridad, las compuertas UV (opcionalmente) también se pueden añadir aguas arriba y aguas abajo del recipiente de cultivo.

El presente método y dispositivo también son una mejora con respecto a la técnica anterior en la medida en que continuamente, en lugar de periódicamente, eliminan por selección la adherencia de variantes resistentes a la dilución a las superficies del quimiostato, ya que el reemplazo de las superficies afectadas tiene lugar en tándem con el proceso de dilución.

El tubo se subdivide de forma transitoria de manera que haya regiones que contengan cultivos saturados (en fase adulta) , regiones que contengan un medio fresco, y una región intermedia, denominada... [Seguir leyendo]

1. Un dispositivo que mejora la tasa de reproducción (mediante una mayor velocidad de reproduccion y/o rendimiento reproductivo) de células vivas en suspensión o cualesquiera organismos cultivables, incluyendo bacterias, arqueas, eucariotas y virus mediante un proceso de selección natural, dicho dispositivo incluye:

a) una tubería flexible estéril (1) que contiene un medio de cultivo,

b) un sistema de compuertas (3, 4, 5) logrado con abrazaderas que dividen la tubería en:

- una región aguas arriba que contiene un medio de cultivo fresco (7) ,

- una cámara de crecimiento (10) que contiene el cultivo situado entre las regiones aguas arriba y aguas abajo,

- y una región aguas abajo que contiene cultivo residual (15) , c) un medio para mover la tubería (1) con respecto a las compuertas (3, 4, 5) , de manera que una porción

(B) de la cámara de crecimiento y del cultivo asociado puedan soltarse y separarse de la cámara de crecimiento, y de manera que una porción (D) de la tubería fresca que contiene medio sin usar pueda unirse a una porción (C) del cultivo y del medio asociado ya presente en la cámara de crecimiento,

caracterizado porque la tubería (1) , el medio y el cultivo dentro de la tubería se mueven mediante el movimiento peristáltico simultáneo de las compuertas.

2. El dispositivo según la reivindicación 1, en el que dicho sistema de compuertas además divide la tubería (1) en una cámara de muestreo (11) situada aguas debajo de dicha cámara de crecimiento.

3. El dispositivo según la reivindicación 1 o 2, en el que dicho sistema de compuertas además divide la tubería (1) en múltiples cámaras de crecimiento, de manera que la compuerta aguas abajo de una cámara de crecimiento se convierta en la compuerta aguas arriba de otra.

4. El dispositivo según la reivindicación 1-3, en el que la tubería es flexible para permitir el apriete y la segregación en cámaras separadas.

5. El dispositivo según la reivindicación 1-4, en el que dichas compuertas están diseñadas como una o más cadenas de múltiples dientes que se mueven simultáneamente.

6. El dispositivo según la reivindicación 1-5, en el que dichas compuertas consisten en un sistema hecho de dos dientes que aprietan el tubo apilándolo, evitando la contaminación entre regiones (G, H) de la tubería gracias a la precisión de la interfaz entre los dientes.

7. El dispositivo según la reivindicación 1-6, en el que la tubería es permeable al gas, por ejemplo compuesto primariamente de silicona para permitir el intercambio de gas entre el organismo cultivado y el exterior, según el tipo de experimento.

8. El dispositivo según la reivindicación 1-6, en el que la tubería es impermeable al gas, para prevenir el intercambio de gas entre el organismo cultivado y el exterior, si el experimento requiere anaerobiosis.

9. El dispositivo según la reivindicación 1-8, en el que la tubería es transparente o translúcida para permitir la medición de la turbidez.

10. El dispositivo según la reivindicación 9, que además comprende un turbidímetro (6) y un sistema de control (13) , para monitorizar la densidad óptica del cultivo y operar un movimiento controlado de la tubería (1) en base a la densidad del cultivo.

11. El dispositivo según la reivindicación 1-10, que además comprende un medio para despresurizar o sobrepresurizar, respecto a la atmosfera ambiente, la tubería de la cámara de crecimiento y medios y cultivos asociados, según lo requieran las necesidades del experimento.

12. El dispositivo según la reivindicación 1-11, que además comprende una línea de indicación de pH incrustada en la pared de la tubería para conseguir la monitorización permanente del pH dentro de la cámara de crecimiento.

13. El dispositivo según la reivindicación 1-12, que además comprende un medio (2) para calentar o enfriar la tubería de la cámara de crecimiento y los medios y cultivos asociados, según sea apropiado para las condiciones del experimento.

14. El dispositivo según la reivindicación 1-13, que además comprende un medio (9) para agitar o mantener sin movimiento la tubería de la cámara de crecimiento y los medios y cultivos asociados.

15. El dispositivo según la reivindicación 14, en el que la tubería puede incluir una o varias barras de agitación para agitar.

16. El dispositivo según la reivindicación 1-15, que además comprende un medio (2) para confinar regiones de la tubería a un área atmosférica específica y controlada para controlar la dinámica de intercambio de gas.

17. El dispositivo según la reivindicación 1-16, que además comprende un medio (2) para bascular la tubería y los medios y cultivos asociados de la cámara de crecimiento bien hacia abajo para eliminar células agregadas o hacia arriba para eliminar aire.

18. Un método que aumenta la tasa de reproducción de células vivas en suspensión o cualesquiera organismos cultivables, incluyendo bacterias, arqueas, eucariotas y virus mediante un proceso de selección natural, que comprende:

a) dividir una tubería flexible estéril (1) que contiene un medio de cultivo (7) mediante el cierre de compuertas (3, 4, 5) en una región aguas arriba (7) que contiene un medio de cultivo fresco, una cámara de crecimiento (10) que contiene el cultivo en crecimiento situado entre las regiones aguas arriba y aguas abajo, una cámara de muestreo (11) situada aguas debajo de dicha cámara de crecimiento, y una región aguas abajo (15) que contiene cultivo residual;

b) proporcionar un cultivo inicial en la cámara de crecimiento (10) descrita mediante una inyección estéril de un fermento láctico;

c) mantener condiciones de crecimiento según requisitos experimentales;

d) después de cierto crecimiento del cultivo aplicar un movimiento peristáltico simultáneo de las compuertas (3, 4, 5) para mover la tubería (1) , y el medio y el cultivo dentro de la tubería, a fin de mover porciones iguales de medio fresco y de cultivo (respectivamente) dentro y fuera de la región definida como cámara de crecimiento, permitiendo que la porción restante del cultivo se mezcle con la porción introducida del medio fresco y continúe creciendo;

e) reproducir los pasos c) y d) hasta el final del experimento para conseguir cultivo continuo y selección de variantes con mayores tasas reproductivas;

f) extracción de una muestra del cultivo de la cámara de muestreo (11) según las necesidades.

19. Un método según la reivindicación 18 en el que el paso c) incluye mantener las condiciones de crecimiento según la temperatura, presión, densidad óptica, acidez química, agitación y/o aireación con varios gases.

20. Un método según la reivindicación 18 o 19 en el que el paso c) además incluye confinar regiones de la tubería a un área atmosférica específica y controlada para controlar la dinámica de intercambio de gas.

21. Un método según la reivindicación 18-20 en el que el paso c) además incluye una combinación de bascular el dispositivo y hacer funcionar agitadores para agitar convenientemente para mezclar el cultivo para prevenir o reprimir la agregación de organismos vivos.

22. Un método según la reivindicación 18-21 en el que el paso a) además comprende dividir la tubería en múltiples cámaras de crecimiento, de manera que la compuerta aguas abajo de una cámara de crecimiento se convierta en la compuerta aguas arriba de otra, y en el que el paso b) además incluye proporcionar un segundo organismo en dicha cámara de crecimiento.