Método y sistema de cultivo celular.

La invención se enmarca dentro de los dispositivos automatizados para el cultivo celular.

La invención presenta un método y un sistema de cultivo celular que permite modificar de manera controlada la densidad y el número de células en un cultivo. En concreto, se presenta un método iterativo cuyo número de etapas de iteración se modifica en función de la demanda de densidad y número de células necesarios durante la duración del cultivo.

Método y sistema de cultivo celular

OBJETO DE LA INVENCIÓN

La invención se enmarca dentro de los dispositivos automatizados para el cultivo celular. La invención presenta un método y un sistema de cultivo celular que permiten modificar de manera controlada la densidad y el número de células en un cultivo. En concreto, se presenta un método iterativo cuyo número de etapas de iteración se modifica en función de la demanda de densidad y el número de células necesarios durante la duración del cultivo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

En el estado de la técnica nos podemos encontrar con biorreactores automatizados, fabricados por empresas como Caridian BCT, PAN-systech o General Electric con su “biorreactor wave”.

La solicitud de patente internacional WO 2010/121601 A2 de PAN-systech muestra un biorreactor automático para cultivos celulares en multipocillo.

Sin embargo, los dispositivos y métodos conocidos en el estado de la técnica presentan el problema técnico de no ser suficientemente versátiles en el sentido de que no permiten realizar múltiples expansiones celulares dentro de un mismo biorreactor a demanda, lo que causa que la densidad celular y el número total de células no se puedan controlar y modificar con precisión conforme se avanza en el proceso de amplificación, y que el rango de valores en el que se puede trabajar sea estrecho.

Estas limitaciones dificultan en gran medida el uso de biorreactores para la terapia celular.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Para solucionar los problemas planteados en el estado de la técnica se ha desarrollado un método de cultivo celular según la reivindicación 1 y un sistema de cultivo celular según la reivindicación 10. Las reivindicaciones dependientes definen realizaciones particulares de la invención.

El primer aspecto inventivo de la invención consiste en el mencionado método de cultivo celular y está caracterizado porque se implementa en un sistema que comprende:

• al menos un dispositivo adaptado para cultivar células, el dispositivo comprendiendo:

• al menos una cámara de biorreacción que comprende al menos una superficie interior adaptada para el cultivo celular,

• medios de entrada-salida de fluidos, y

• al menos una precámara en conexión con la al menos una cámara de biorreacción que comprende una entrada para introducir células,

y porque comprende las siguientes etapas:

a) llenar la precámara de medio de cultivo a unas condiciones fisicoquímicas de partida con un volumen de líquido predeterminado, b) introducir células a través de la entrada de células para introducir células de la precámara, c) hacer pasar el medio de cultivo con las células a la al menos una cámara de biorreacción, d) dejar depositar las células y dejarlas reposar un tiempo predeterminado hasta que se adhieren a la al

menos una superficie interior adaptada para el cultivo celular cuyas propiedades fisicoquímicas hacen que a una o unas de las condiciones fisicoquímicas de partida se comporte de manera que favorece la adhesión celular,

e) circular medio de cultivo a través del dispositivo y a través de los medios de entrada-salida de fluidos f) una vez obtenido un número de células objetivo o alcanzada una densidad crítica en la al menos una cámara de biorreacción utilizada para el cultivo, variar al menos una de las condiciones fisicoquímicas de partida del medio de cultivo a unas condiciones fisicoquímicas modificadas a las cuales se impide la adhesión celular, de forma tal que el volumen que permanece dentro del dispositivo a unas condiciones fisicoquímicas modificadas queda en las cámaras que se han utilizado para la amplificación celular,

g) trasladar el medio de cultivo con las células a la precámara, y

si se ha alcanzado el número de células objetivo introducir en la precámara un volumen adicional de medio de cultivo y extraer el medio de cultivo con las células en suspensión a través de unos medios de salida, o si no se ha alcanzado el número de células objetivo, introducir medio de cultivo adicional en la precámara y repetir las etapas desde c) .

El método de la invención tiene por objeto permitir modificar de manera controlada la densidad y el número de células en un cultivo. En concreto, se presenta un método iterativo cuyo número de etapas de iteración se modifica en función de la demanda de densidad y número de células necesario durante la duración del cultivo.

En concreto, el método iterativo se inicia con la introducción de medio de cultivo en la precámara del dispositivo de manera que se tenga el medio separado de la al menos una cámara de biorreacción. Es entonces cuando se introducen las células objeto de ser amplificadas y posteriormente se traslada toda la mezcla formada por el medio y las células a la al menos una cámara de cultivo a través de la conexión entre la precámara y la cámara.

A lo largo de este documento, se entienden como sinónimos los términos “amplificación celular” y “cultivo celular”. Por otra parte, cuando se habla de condiciones fisicoquímicas se refiere a las condiciones particulares de al menos un parámetro, como la temperatura, el nivel de pH o la concentración salina o similares.

Para realizar un proceso de amplificación celular con éxito, es conveniente que las células se adhieran a una superficie donde inician procesos de división celular. Por ello, la siguiente etapa del método comprende dejar reposar las células de manera que se adhieren a una superficie interior del dispositivo en la al menos una cámara de biorreacción adaptada para el cultivo celular. Esta superficie está adaptada para cambiar su adecuación para la adhesión celular en función del valor de al menos una de las condiciones fisicoquímicas de partida, por ejemplo, la temperatura, el pH o la concentración salina, ya sea debido a la naturaleza del material con el que se ha fabricado, o por estar recubierta con un gel o un producto cuyas propiedades varían con la al menos una de las condiciones fisicoquímicas de partida seleccionada, por ejemplo, la temperatura. La al menos una de las condiciones fisicoquímicas de partida del medio de cultivo, por ejemplo una primera temperatura T1, está seleccionada de manera que la característica que presenta la superficie interior a esa temperatura es tal que permite la adhesión celular.

Cuando las células se han adherido a la superficie, se procede a iniciar un flujo continuo de medio de cultivo a unas condiciones fisicoquímicas de partida. Este flujo continuo dota a las células de nutrientes necesarios, tales como aminoácidos y vitaminas, de manera continuada y renovada para que el ritmo de crecimiento sea constante y óptimo. Así, se lleva a cabo la amplificación celular hasta obtener una densidad de células determinada, a partir de la cual la calidad del cultivo no es la requerida, o un número de células objetivo.

Una vez que se ha obtenido esta densidad o este número de células objetivo se varía al menos una de las condiciones fisicoquímicas de partida del medio a unas condiciones fisicoquímicas modificadas, para las cuales, la superficie adaptada para el cultivo celular presenta una característica fisicoquímica tal que permite que las células queden de nuevo en suspensión en el medio.

En un ejemplo de realización no limitativo la manera de variar al menos una de las condiciones fisicoquímicas es vaciar las cámaras de biorreacción de medio de cultivo a temperatura T1 y llenar posteriormente las cámaras de cultivo que contienen células de medio a temperatura T2. En un ejemplo particular el volumen de medio que se introduce en cada cámara a las condiciones fisicoquímicas modificadas es el volumen que se ha introducido en cada cámara al inicio del proceso. De esta manera las células a estas condiciones fisicoquímicas modificadas se despegan de las superficies adaptadas para la adhesión celular. Posteriormente, se traslada el medio líquido con las células en suspensión hacia la precámara.

Una vez el medio líquido a unas condiciones fisicoquímicas modificadas y las células en suspensión están en la precámara, existen dos opciones: • o bien se precisa una mayor cantidad de células, en cuyo caso se añade más medio de cultivo a la precámara y se repiten todos los pasos desde c) hasta alcanzar el número de células objetivo, o • se ha alcanzado el número de células objetivo, en cuyo caso se procede a la extracción del medio líquido con las células en suspensión de la precámara.

El método aporta la ventaja técnica de poder controlar en vivo el número de células requerido... [Seguir leyendo]

1. Método de cultivo celular caracterizado porque está implementado en un sistema que comprende:

• al menos un dispositivo (1) adaptado para cultivar células, el dispositivo (1) comprendiendo:

• al menos una cámara de biorreacción (2) que comprende al menos una superficie interior (3, 22, 39) adaptada para el cultivo celular,

• medios de entrada-salida de fluidos (13, 14, 15, 17, 18, 19, 23, 24) , y

• al menos una precámara (4) en conexión con la al menos una cámara de biorreacción (2) , que comprende una entrada (5) para introducir células,

y porque comprende las siguientes etapas:

a) llenar la precámara (4) de medio de cultivo a unas condiciones fisicoquímicas de partida con un volumen de líquido predeterminado, b) introducir células en la precámara (4) a través de la entrada de células (5) , c) hacer pasar el medio de cultivo con las células a la al menos una cámara de biorreacción (2) , d) dejar depositar las células y dejarlas reposar un tiempo predeterminado hasta que se adhieren a la al

menos una superficie interior (3, 22, 39) adaptada para el cultivo celular cuyas propiedades fisicoquímicas hacen que a una o unas condiciones fisicoquímicas de partida se comporte de manera que favorece la adhesión celular,

e) circular medio de cultivo a través del dispositivo (1) y a través de los medios de entrada-salida de fluidos (13, 14, 15, 17, 18, 19, 23, 24) ,

f) una vez obtenido un número de células objetivo o alcanzada una densidad crítica en la al menos una cámara de biorreacción (2, 2’, 2’’) utilizada para el cultivo, variar al menos una de las condiciones fisicoquímicas de partida del medio de cultivo a unas condiciones fisicoquímicas modificadas a las cuales se impide la adhesión celular, de forma tal que el volumen que permanece dentro del dispositivo (1) a unas condiciones fisicoquímicas modificadas queda en las cámaras de biorreacción (2, 2’, 2’’) que se han utilizado para la amplificación celular, g) hacer pasar el medio de cultivo con las células a la precámara (4) , y si se ha alcanzado el número de células objetivo, extraer el medio de cultivo con las células en suspensión a través de unos medios de salida (24) , o si no se ha alcanzado el número de células objetivo, introducir medio de cultivo adicional en la precámara y repetir las etapas desde c) .

2. Un método según la reivindicación 1 caracterizado porque la al menos una de las condiciones fisicoquímicas de partida que se varía es la temperatura.

3. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende controlar automáticamente el número y/o la densidad de células mediante al menos una unidad de control (20) adaptada para controlar el cultivo celular llevado a cabo en el dispositivo (1) .

4. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el control del número y/o la densidad de células se realiza por medio de una unidad de control (20) que comprende un sistema de control óptico (21) y a través de una superficie transparente (22) comprendida en el dispositivo, el control del número de células comprendiendo la etapa:

• una vez el medio de cultivo ha pasado a la al menos una cámara de biorreacción (2) , posicionar el dispositivo (1) de manera que el medio de cultivo con las células en suspensión queda sobre la superficie transparente (22) y a su vez esta superficie transparente (22) queda posicionada sobre el sistema de control óptico (21) para controlar el número y/o la densidad de células .

5. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende una etapa de esterilización del sistema mediante un sistema de esterilización (33) conectado con dicho sistema.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque el trasvase entre precámara

(4) y la al menos una cámara de biorreacción (2, 2’, 2’’) se realiza por presión, de manera que el medio atraviesa unas válvulas (14, 18, 23) .

7. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque tras extraer el medio de cultivo con las células en suspensión a través de los medios de entrada-salida de fluidos (24) , las células se separan del medio de cultivo mediante:

• un medio líquido contenido en una cámara (26) ,

• al menos un sistema de filtrado (25) conectado a dicha cámara (26) , el cual comprende:

• unos medios de entrada-salida para el medio líquido (29) ,

• unos medios de entrada-salida para el medio de cultivo (28, 32) ,

• al menos un filtro (31) ,

y porque se implementan las etapas:

• introducir el medio de cultivo con las células en el sistema de filtrado (25) ,

• retener las células con el al menos un filtro (31) ,

• introducir medio líquido en el sistema de filtrado (25) a través de los medios entrada-salida para el medio líquido (29) ,

de manera que se lleva a cabo la separación de las células del medio de cultivo.

8. Un método según la reivindicación 7, caracterizado por que la separación de las células del filtro se produce por la vibración de dicho filtro mediante al menos un vibrador (37) comprendido en dicho filtro.

9. Un método según cualquiera de las reivindicaciones caracterizado por que se realizan cultivos de distinta índole mediante un sistema que comprende una pluralidad de dispositivos extraíbles, cada uno de estos dispositivos utilizando al menos una superficie interna apropiada para el tipo de cultivo que se quiere realizar.

10. Sistema de cultivo celular que comprende:

• al menos un dispositivo (1) adaptado para cultivar células, el dispositivo (1) comprendiendo:

• al menos una cámara de biorreacción (2) que comprende al menos una superficie interior (3, 22, 39) adaptada para el cultivo celular,

• medios de entrada-salida de fluidos (13, 14, 15, 17, 18, 19, 23, 24) , y

• al menos una precámara (4) en conexión con la al menos una cámara de biorreacción (2) que comprende una entrada (5) para introducir células.

11. Un sistema según la reivindicación 10 caracterizado por que comprende una unidad de control (20) adaptada para llevar a cabo el método de control del cultivo celular según la reivindicación 1.

12. Un sistema según la reivindicación 10, caracterizado por que al menos una de las superficies interiores (3) del dispositivo es transparente, formando una superficie transparente (22) y la unidad de control (20) comprende al menos un sistema de control óptico (21) de manera que se implementa un método de control según la reivindicación 3.

13. Un sistema según cualquiera de las reivindicaciones de la 10 a la 12 caracterizado por que comprende al menos un sistema de esterilización (33) .

14. Un sistema según cualquiera de las reivindicaciones de la 10 a la 13 caracterizado por que comprende:

• al menos una cámara para contener un medio líquido (26) ,

• al menos un sistema de filtrado (25) que comprende:

• unos medios de entrada-salida para el medio líquido (29) ,

• unos medios de entrada salida para el medio de cultivo (28, 32) ,

• al menos un filtro (31) ,

• unos medios para el transporte de medio líquido (27) entre la cámara para contener un medio líquido

(26) y el al menos un sistema de filtrado (25) .

15. Un sistema según cualquiera de las reivindicaciones de la 10 a la 14 caracterizado por que comprende válvulas de entrada-salida (14) de la precámara (4) a la cámara de biorreacción (2) y/o válvulas de entrada-salida de gases (15, 19) .

16. Un sistema según cualquiera de las reivindicaciones de la 10 a la 15 caracterizado porque comprende superficies adicionales de adhesión celular (39) en al menos una cámara de biorreacción (2) , preferentemente proteínas, péptidos o moléculas sintéticas activas biológicamente.

17. Un sistema según cualquiera de las reivindicaciones de la 10 a la 16, caracterizado porque la al menos una superficie interior (22, 3, 39) adaptada para el cultivo celular está recubierta de un gel.

18. Un sistema según la reivindicación 17 caracterizado porque el gel es un hidrogel poly (n-isopropil acrilamida) .

19. Un sistema según cualquiera de las reivindicaciones de la 14 a la 18 caracterizado porque el sistema de filtrado (25) comprende un medio vibrador (37) .

20. Un sistema según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque el dispositivo (1) es extraíble.