Un método para preparar un conjugado que comprende un agente de unión celular y uno o más fármacos de molécula pequeña,

en el que dicho conjugado está representado por la fórmula (V): en la que CB representa el agente de unión celular, A representa el fármaco de molécula pequeña unido por un resto disulfuro, R, R1, R2 y R3 son iguales o diferentes y son H, metilo, etilo, o alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 3 a 6 átomos de carbono, n es 0 o un número entero de 1 a 4, y m es un número entero de 1 a 10 o más, comprendiendo dicho método: 10 (1) hacer reaccionar el agente de unión celular con un reticulante de fórmula (I): en la que X e Y son iguales o diferentes y son H, CONR4R5 o NO2 con la condición de que X e Y no sean ambos H al mismo tiempo, R4 y R5 son iguales o diferentes y son cada uno H, metilo, etilo, npropilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, iso-butilo o terc-butilo, y Z es SO3M + o H, donde M + representa un ión metálico o un ión tetraalquilamonio, para dar de este modo un compuesto de fórmula (III): en la que p representa un número entero de 1 a 10 o más, y (2) hacer reaccionar el compuesto de fórmula (III) con uno o más fármacos de molécula pequeña que 20 comprenden un grupo tiol libre

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

Esta solicitud reivindica prioridad a la solicitud provisional de Estados Unidos Nº 60/403.652,presentada el 16 de agosto de 2002.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un método mejorado para preparar conjugados de agentesde unión celular y fármacos de molécula pequeña, especialmente agentes citotóxicos.

La presente invención también se refiere a nuevos reticulantes bifuncionales y métodos parapreparar agentes de unión celular que comprenden un reticulante capaz de reaccionar con fármacos de molécula pequeña. El método mejorado para preparar conjugados proporciona a los conjugados enlacesdisulfuro estéricamente impedidos para potenciar la estabilidad in vivo del enlace disulfuro y,inesperadamente, tiene una velocidad de reacción aumentada con fármacos de molécula pequeña quealbergan un grupo tiol libre. La reacción es aproximadamente 12 veces más rápida que con los reticulantes descritos previamente.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El reactivo de modificación bifuncional 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP) se ha usado para unir dos proteínas juntas a través de un enlace disulfuro. El reactivo se hace reaccionar con la primera proteína para introducir un grupo que contiene disulfuro activo en la etapa de modificación.Una segunda proteína, que contiene un grupo tiol libre, se añade después para formar un enlace disulfuroentre las dos proteínas en la etapa de conjugación. Se han descrito muchos derivados de SPDP y versiones imida de SPDP (patente de Estados Unidos 4.563.304; J. Carlsson et al. 173 Biochem. J. 723737 (1978); Goff D. A., Carroll, S. F. 1 BioConjugate Chem. 381-386 (1990); L. Delprino et al. 82 J. Pharm. Sci. 506-512 (1993); S. Arpicco et al., 8 BioConjugate Chem 327-337 (1997)).

Se han descrito conjugados de agentes de unión celular con fármacos altamente citotóxicos(patentes de Estados Unidos Nº 5.208.020 y 5.416.064; R.V.J. Chari et al., 52 Cancer Res. 127-131(1992). En estos conjugados, los agentes de unión celular primero se modifican con un agente bifuncional tal como SPDP para introducir un resto disulfuro activo. La reacción con un fármaco citotóxico quecontiene tiol proporciona un conjugado en el que el agente de unión celular, tal como un anticuerpomonoclonal, y el fármaco se unen mediante enlaces disulfuro. Para potenciar la estabilidad in vivo de este enlace disulfuro, es importante para proporcionar enlaces disulfuro estéricamente impedidos. Esteobjetivo puede conseguirse usando reticulantes que albergan uno o dos sustituyentes metilo en el átomo de carbono geminal al enlace disulfuro o usando fármacos que albergan uno o dos sustituyentes metilo enel átomo de carbono que alberga el sustituyente tiol. Sin embargo, la introducción de dichos enlacesdisulfuro impedidos sobre agentes de unión celular o tioles impedidos sobre los fármacos provoca una marcada disminución en la velocidad de reacción del fármaco que contiene tiol y el agente de unióncelular. Por tanto, los procesos para la producción de conjugados llegan a ser imposibles, o muy costosos en tiempo y poco rentables. Además, el prolongado tiempo de reacción causa dimerización no deseadadel fármaco que contiene tiol y la consiguiente pérdida de reactividad y bajos rendimientos de producto. En el caso de anticuerpos monoclonales y fragmentos de los mismos, las lentas velocidades de reaccióndel intercambio de disulfuro entre el enlace disulfuro impedido y el fármaco que contiene tiol conduce a la reacción secundaria indeseada de la escisión del enlace disulfuro entre las cadenas pesada y ligera del anticuerpo o fragmento.

Por tanto, existe la necesidad de proporcionar reticulantes que proporcionarán una velocidadde reacción acelerada de la reacción de intercambio de disulfuro entre el agente de unión celularmodificado y el sustituyente tiol sobre el fármaco citotóxico. Además, como los agentes de unión celular, tales como los anticuerpos monoclonales, son solamente solubles en soluciones acuosas, también esdeseable proporcionar reticulantes que sean solubles en agua o requieran solamente un pequeñoporcentaje (<5% v/v) de un disolvente orgánico para mantener la solubilidad en soluciones acuosas.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención cumple estos y otros objetos proporcionando un método para prepararun conjugado que comprenda un agente de unión celular y uno o más fármacos de molécula pequeña,donde dicho conjugado está representado por la fórmula (V):

**(Ver fórmula)**

en la que CB representa el agente de unión celular, A representa el fármaco de molécula pequeña unidopor un resto disulfuro, R, R1, R2 y R3 son iguales o diferentes y son H, metilo, etilo, o alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 3 a 6 átomos de carbono, n es 0 o un número entero de 1 a 4, y m es unnúmero entero de 1 a 10 o más, comprendiendo dicho método:

(1) hacer reaccionar el agente de unión celular con un reticulante de fórmula (I) o (II):

**(Ver fórmula)**

en las que X e Y son iguales o diferentes y son H, CONR4R5 o NO2, con la condición de que X e Y no 10 sean ambos H al mismo tiempo, R4 y R5 son iguales o diferentes y son cada uno H, metilo, etilo, n-propilo,

- M+

isopropilo, n-butilo, sec-butilo, iso-butilo o terc-butilo, y Z es SO3 o H, donde M+ representa un ión metálico o un ión tetraalquilamonio, para dar de este modo un compuesto de fórmula (II) o (IV),respectivamente:

en las que p representa un número entero de 1 a 10 o más, y

(2) hacer reaccionar el compuesto de fórmula (III) o (IV) con uno o más fármacos de molécula pequeña que comprenden un grupo tiol libre.[0008] La invención también proporciona un método para preparar un conjugado que comprende un agente de unión celular y uno o más fármacos de molécula pequeña, donde dicho conjugado está representado por la fórmula (V), comprendiendo dicho método: hacer reaccionar un compuesto de fórmula

(III) o (IV), con uno o más fármacos de molécula pequeña que comprenden un grupo tiol libre.

En una realización preferida, el agente de unión celular es un anticuerpo o fragmento de unión25 a antígeno del mismo y el fármaco de molécula pequeña es un agente citotóxico.

La invención también proporciona un reticulante de fórmula (I) o (II):

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

en las que R, R1, R2 y R3 son iguales o diferentes y son H, metilo, etilo, o alquilo lineal, ramificado o cíclicoque tiene de 3 a 6 átomos de carbono, n es 0 o un número entero de 1 a 4, X e Y son iguales o diferentesy son CONR4R5 o NO2, R4 y R5 son iguales o diferentes y son cada uno H, metilo, etilo, n-propilo,

- M+

isopropilo, n-butilo, sec-butilo, iso-butilo o terc-butilo, y Z es SO3 o H, donde M+ representa un ión metálico o un ión tetraalquilamonio, con la condición de que cuando X y/o Y es NO2, Z no sea H.

La invención proporciona adicionalmente un método para preparar un agente de unión celularque comprende un enlazador capaz de unir el agente de unión celular a un fármaco de molécula pequeña, comprendiendo el agente de unión celular un enlazador que está representado por la fórmula

(III) o (IV), que comprende hacer reaccionar el agente de unión celular con un reticulante de fórmula (I) o (II), respectivamente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS GRÁFICOS

La Figura 1 muestra la síntesis de reactivos reticulantes heterobifuncionales que contienen ungrupo 2-(nitropiridil)-disulfuro o un grupo 2-(dinitropiridil)-disulfuro y un éster de ácido carboxílico reactivo.Primero se hace reaccionar un compuesto de ácido mercapto-carboxílico con un compuesto 2,2'-di(nitropiridil)-disulfuro o 2,2'-di-(dinitropiridil)-disulfuro y el resto de ácido carboxílico después se esterifica con N-hidroxisuccinimida o N-hidroxisulfosuccinimida. Como ejemplo, el 1,3-dibromobutano se convirtió en ácido 4-mercaptopentanoico, que después se convirtió en el reactivo reticulante correspondiente.

La Figura 2 muestra la síntesis de los agentes reticulantes heterobifuncionales N-succinimidil-4(2-piridilditio)butirato (SPDB), N-succinimidil-4-(5-nitro-2-piridilditio)butirato (SNPB) y N-sulfosuccinimidil-4(5-nitro-2-piridilditio)butirato (SSNPB), derivados del ácido 4-mercaptobutírico. El SPDB es un ejemplo de referencia y no forma... [Seguir leyendo]

1. Un método para preparar un conjugado que comprende un agente de unión celular y uno o másfármacos de molécula pequeña, en el que dicho conjugado está representado por la fórmula (V):

**(Ver fórmula)**

en la que CB representa el agente de unión celular, A representa el fármaco de molécula pequeñaunido por un resto disulfuro, R, R1, R2 y R3 son iguales o diferentes y son H, metilo, etilo, o alquilolineal, ramificado o cíclico que tiene de 3 a 6 átomos de carbono, n es 0 o un número entero de 1 a 4,y m es un número entero de 1 a 10 o más, comprendiendo dicho método:

10 (1) hacer reaccionar el agente de unión celular con un reticulante de fórmula (I):

**(Ver fórmula)**

en la que X e Y son iguales o diferentes y son H, CONR4R5 o NO2 con la condición de que X e Y no sean ambos H al mismo tiempo, R4 y R5 son iguales o diferentes y son cada uno H, metilo, etilo, npropilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, iso-butilo o terc-butilo, y Z es SO3M+ o H, donde M+ representa un ión metálico o un ión tetraalquilamonio, para dar de este modo un compuesto de fórmula (III):

**(Ver fórmula)**

en la que p representa un número entero de 1 a 10 o más, y

(2) hacer reaccionar el compuesto de fórmula (III) con uno o más fármacos de molécula pequeña que 20 comprenden un grupo tiol libre.

2. en la que CB representa el agente de unión celular, A representa el fármaco de molécula pequeña unido por un resto disulfuro, R, R1, R2 y R3 son iguales o diferentes y son H, metilo, etilo, o alquilolineal, ramificado o cíclico que tiene de 3 a 6 átomos de carbono, n es 0 o un número entero de 1 a 4,y m es un número entero de 1 a 10 o más, comprendiendo dicho método:

(1) hacer reaccionar el agente de unión celular con un reticulante de fórmula (II):

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

en la que X e Y son iguales o diferentes y son H, CONR4R5 o NO2, con la condición de que X e Y no sean ambos H al mismo tiempo, R4 y R5 son iguales o diferentes y son cada uno H, metilo, etilo, n

- M+

propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, iso-butilo o terc-butilo, y Z es SO3 o H, donde M+ representa un ión metálico o un ión tetraalquilamonio,para dar de este modo un compuesto de fórmula (IV):

**(Ver fórmula)**

en la que p representa un número entero de 1 a 10 o más, y

(2) hacer reaccionar el compuesto de fórmula (IV) con uno o más fármacos de molécula pequeñaque comprenden un grupo tiol libre.

3. en la que CB representa el agente de unión celular, A representa el fármaco de molécula pequeña unido por un resto disulfuro, R, R1, R2 y R3 son iguales o diferentes y son H, metilo, etilo, o alquilolineal, ramificado o cíclico que tiene de 3 a 6 átomos de carbono, n es 0 o un número entero de 1 a 4,y m es un número entero de 1 a 10 o más, comprendiendo dicho método: hacer reaccionar un compuesto de fórmula (III)

**(Ver fórmula)**

en la que X e Y son iguales o diferentes y son H, CONR4R5 o NO2 con la condición de que X e Y no sean ambos H al mismo tiempo, R4 y R5 son iguales o diferentes y son cada uno H, metilo, etilo, npropilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, iso-butilo o terc-butilo, y p representa un número entero de 1 a10 o más, con uno o más fármacos de molécula pequeña que comprenden un grupo tiol libre.

4.

en la que CB representa el agente de unión celular, A representa el fármaco de molécula pequeña

30 unido por un resto disulfuro, R, R1, R2 y R3 son iguales o diferentes y son H, metilo, etilo, o alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 3 a 6 átomos de carbono, n es 0 o un número entero de 1 - 4,y m es un número entero de 1 a 10 o más, comprendiendo dicho método: hacer reaccionar un compuesto de fórmula (IV):

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

en la que X e Y son iguales o diferentes y son H, CONR4R5 o NO2, con la condición de que X e Y no sean ambos H al mismo tiempo, R4 y R5 son iguales o diferentes y son cada uno H, metilo, etilo, npropilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, iso-butilo o terc-butilo, y p representa un número entero de 1 a10 o más, con uno o más fármacos de molécula pequeña que comprenden un grupo tiol libre.

**(Ver fórmula)**

en la que R, R1, R2 y R3 son iguales o diferentes y son H, metilo, etilo, o alquilo lineal, ramificado o10 cíclico que tiene de 3 a 6 átomos de carbono, n es 0 o un número entero de 1 a 4, X e Y son iguales

o diferentes y son CONR4R5 o NO2, R4 y R5 son iguales o diferentes y son cada uno H, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, iso-butilo o terc-butilo, y Z es SO3M+ o H, donde M+ representa un ión metálico o un ión tetraalquilamonio, con la condición de que cuando X y/o Y esNO2 Z no sea H.

**(Ver fórmula)**

en la que R, R1, R2 y R3 son iguales o diferentes y son H, metilo, etilo, o alquilo lineal, ramificado ocíclico que tiene de 3 a 6 átomos de carbono, n es 0 o un número entero de 1 a 4, X e Y son iguales

o diferentes y son CONR4R5 o NO2, R4 y R5 son iguales o diferentes y son cada uno H, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, iso-butilo o terc-butilo, y Z es SO3M+ o H, donde M+ representa un ión metálico o un ión tetraalquilamonio, con la condición de que cuando X y/o Y esNO2 Z no sea H.

**(Ver fórmula)**

en la que CB representa un agente de unión celular, R, R1, R2 y R3 son iguales o diferentes y son H,metilo, etilo, o alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 3 a 6 átomos de carbono, n es 0 o unnúmero entero de 1 a 4, X e Y son iguales o diferentes y son H, CONR4R5 o NO2 con la condición de que X e Y no sean ambos H al mismo tiempo, R4 y R5 son iguales o diferentes y son cada uno H, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, iso-butilo o terc-butilo, y p representa unnúmero entero de 1 a 10 o más, que comprende hacer reaccionar el agente de unión celular, CB, con un reticulante de fórmula (I):

**(Ver fórmula)**

8. Un método para preparar un compuesto de fórmula (IV):

en la que CB representa un agente de unión celular, R, R1, R2 y R3 son iguales o diferentes y son H,metilo, etilo, o alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 3 a 6 átomos de carbono, n es 0 o unnúmero entero de 1 a 4, X e Y son iguales o diferentes y son H, CONR4R5 o NO2 con la condición de que X e Y no sean ambos H al mismo tiempo, R4 y R5 son iguales o diferentes y son cada uno H,metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, iso-butilo o terc-butilo, y p representa un número entero de 1 a 10 o más, que comprende hacer reaccionar el agente de unión celular con unreticulante de fórmula (II):

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, 7, 8, en el que el agente de unión celular es un20 anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el fármaco de molécula pequeña esun agente citotóxico.

25 12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el fármaco de molécula pequeña es al menos un miembro seleccionado entre el grupo compuesto por un compuesto de maitansinoide, un compuesto de taxano, un compuesto de CC-1065, un compuesto de daunorrubicina, un compuesto de doxorrubicina, y análogos o derivados de los mismos.

30 13. El método o reticulante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que tanto R como R1 son H

o metilo, o uno de R y R1 es H y el otro es metilo.

14. El método o reticulante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que n es 1, R1 es metilo, y R, R2 y R3 son H.

15. El método o reticulante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que n es 1, y R, R1, R2 y R3 son H.

16. El método o reticulante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que n es 1, y R y R1 son40 ambos metilo, y R2 y R3 son ambos H.