Un conjugado anticuerpo-fármaco que comprende un anticuerpo que se une a CD70 y que está conjugado con un agente citotóxico,

para el tratamiento de un cáncer que expresa CD70 en un sujeto

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

CD70 es un miembro de la familia de los factores de necrosis tumoral (TNF) de moléculas asociadas a membranas celulares y secretadas que son expresadas por una diversidad de tipos celulares normales y malignos. La secuencia primaria de ami-noácidos (AA) de CD70 predice una proteína transmembrana de tipo II con su extremo 5 carboxilo expuesto al exterior de las células, y su extremo amino localizado en el lado citosólico de la membrana plasmática (Bowman et al., 1994, J Immunol 152:1756-61; Goodwin et al., 1993, Cell 73:447-56). El CD70 humano está compuesto de un dominio citoplasmático de 20 AA, un dominio transmembrana de 18 AA, y un dominio extraci-toplasmático de 155 AA con dos sitios potenciales de N-glicosilación (Bowman et al., 10 anteriormente mencionado; Goodwin et al., anteriormente mencionado). La inmuno-precipitación específica de células que expresan CD70 marcadas con radioisótopos mediante anticuerpos anti-CD70 produce polipéptidos de 29 y 50 kDa (Goodwin et al., anteriormente mencionado; Hintzen et al., 1994, J Immunol 152:1762-73). Basándose en su homología respecto de TNF-α y TNF-β, en especial en las cadenas estructurales 15 C, D, H e I, se predice una estructura trimérica para CD70 (Petsch et al., 1995, Mol Immunol 32:761-72).

Los estudios inmunohistológicos originales revelaron que CD70 se expresa en las células B de los centros germinales y en pocas células T en amígdalas, piel, e in-testino (Hintzen et al., 1994, Int Immunol 6:477-80). Posteriormente, se informó que 20 CD70 se expresa en la superficie celular de linfocitos T y B recién activados por antí-genos, y su expresión decae tras la retirada de la estimulación antigénica (Lens et al., 1996, Eur J Immunol 26:2964-71; Lens et al., 1997, Immunology 90:38-45). En el sis-tema linfoide, las células citotóxicas (Orengo et al., 1997, Clin Exp Immunol 107:608-13) y las células dendríticas periféricas maduras de ratón (Akiba et al., 2000, J Exp 25 Med 191:375-80) también expresan CD70. En los linajes que no son linfoides, se ha detectado CD70 en las células epiteliales medulares del timo (Hintzen et al., 1994, anteriormente mencionado; Hishima et al., 2000, Am J Surg Pathol 24:742-46).

Además de la expresión en células normales, se ha informado de la expresión de CD70 en diferentes tipos de cánceres, que incluyen linfomas, carcinomas, y tumo-30 res de origen neural. En las células B malignas, se ha informado que un 71% de los linfomas de células B grandes difusos, un 33% de los linfomas foliculares, un 25% de los linfomas del manto, y un 50% de los B-CLL expresan CD70 (Lens et al., 1999, Br J Haematol 106:491-503). CD70 se expresa con frecuencia junto con otros marcadores de activación linfoides en las células malignas de Hodgkin y de Reed-Sternberg de la 35

enfermedad de Hodgkin (Gruss y Kadin, 1996, Bailieres Clin Haematol 9:417-46). Un informe demuestra la expresión de CD70 en un 88% (7 de 8 casos) de carcinomas tímicos y un 20% (1 de 5 casos) de timomas atípicos (Hishima et al., 2000, anterior-mente mencionado). El segundo tipo de carcinoma en el que se ha detectado CD70 es el carcinoma nasofaríngeo. Un estudio informa de la presencia de CD70 en el 80% (16 5 de 20 casos) de biopsias de tumores congeladas rápidamente obtenidas de carcino-mas nasofaríngeos indiferenciados (Agathanggelou et al., 1995, Am J Path 147:1152-60). También se ha detectado CD70 en células de tumores cerebrales, en especial en líneas celulares de gliomas, gliomas humanos sólidos, y meningiomas (Held-Feindt y Mentlein, 2002, Int J Cancer 98:352-56; Wischlusen et al., 2002, Can Res 62:2592-99). 10

Se ha propuesto que los virus transformantes, que incluyen el virus de Epstein-Barr (EBV) y el virus de la leucemia T humana 1 (HTLV-1) pueden inducir CD70 en células tales como las células epiteliales, que normalmente no expresan CD70 (Agathanggelou et al., anteriormente mencionado; Stein et al., 1989, Oxford University Press, pág. 446). Por lo tanto, la expresión de CD70 en las células B malignas podría 15 ser un reflejo de una transformación oncogénica (Lens et al., 1999, anteriormente mencionado). Además, debido a que la expresión de CD70 se induce en las células B tras el encuentro con un antígeno (Maurer et al., 1990, Eur J Immunol 20:2679-84; Lens et al., 1996, anteriormente mencionado), la expresión estable de CD70 podría reflejar una estimulación antigénica prolongada. Se ha postulado que esto ocurre en 20 los linfomas no Hodgkin foliculares basándose en una hipermutación somática en de-sarrollo (Bahler et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:6770-74; Bahler et al., 1992, Cancer Res 52:supl. 5547S-51S).

El receptor de CD70 es CD27, una proteína transmembrana de tipo I glicosi-lada de alrededor de 55 kDa (Goodwin et al., 1993, Cell 73:447-56; Hintzen et al., 25 1994, anteriormente mencionado). CD70 se denomina a veces CD27L. CD27, que existe en forma de un homodímero en la superficie celular (Gravestein et al., 1993, Eur J Immunol 23:943-50), es un miembro de la superfamilia de receptores de TNF tal como se define por las repeticiones ricas en cisteína de alrededor de 40 aminoácidos en el dominio extracelular (Smith et al., 1990, Science 248:1019-23; Locksley et al., 30 2001, Cell 104:487-501). CD27 se expresa en general en los timocitos, en las células citotóxicas, y en las células T y B (Hintzen et al., 1994, Immunol Today 15:307-11; Lens et al., 1998, Semin Immunol 10:491-99). En las células T en reposo, CD27 se expresa de manera constitutiva, aunque el desencadenamiento antigénico estimula adicionalmente la expresión de CD27 (de Jong et al., 1991, J Immunol 146:2488-94; 35

Hintzen et al., 1993, J Immunol. 151:2426-35). Además, el desencadenamiento de las células T a través de su complejo antígeno-receptor de células T solo o en combina-ción con la molécula secundaria CD28 libera CD27 soluble de las células T activadas (Hintzen et al., 1991, J Immunol 147:29-35). Las células B sin exposición previa no expresan CD27, pero su expresión se induce y, al contrario de CD70, se mantiene tras 5 el desencadenamiento antigénico de las células B (Jacquot S et al., 1997 J Immunol 159:2652-57; Kobata T et al., 1995, Proc Natl Acad Sci USA 92:11249-53).

En contraste notable con la expresión limitada de CD27 y CD70 en células nor-males de linaje B, tanto CD27 como CD70 se co-expresan frecuentemente en muchos linfomas no Hodgkin y leucemias de células B. Esto podría conducir potencialmente a 10 interacciones funcionales CD27-CD70 en estas células en forma de un bucle auto-crino, lo que daría como resultado la señalización de CD27 y la proliferación inducida por CD70, por lo que se proporcionaría una ventaja de crecimiento a las células malig-nas (Lens et al., 1999, anteriormente mencionado).

Los datos disponibles apoyan un modelo en el que la unión de CD27 en los 15 linfocitos activados mediante CD70 comunica señales a las células que expresan CD27, lo que incluye señales co-estimuladoras en las células T, B, y citotóxicas (véase, p.ej., Goodwin et al., anteriormente mencionado; Hintzen et al., 1995, J Immunol 154:2612-23; Oshima et al., 1998, Int Immunol 10:517-26; Smith et al., ante-riormente mencionado; Van Lier et al., 1987, J Immunol 139:1589-96; Gravestein et al., 20 1995, Int Immunol 7:551-7; Tesselaar et al., 1997, J Immunol 159:4959-65; Jacquot et al., anteriormente mencionado; Agematsu et al., 1998, Blood 91:173-80; Kobata et al., anteriormente mencionado; Agematsu et al., 1997, Eur J Immunol 27:2073-79; Sugita et al., 1992, J Immunol 149:1199-1203; Orengo et al., 1997, Clin Exp Immunol 107:608-13). Se ha demostrado que los anticuerpos contra CD70 murino y humano 25 inhiben dichas actividades, supuestamente bloqueando la interacción CD70/CD27 (Hintzen et al., 1994, anteriormente mencionado; Hintzen et al., 1995, anteriormente mencionado; Oshima et al., anteriormente mencionado).

Hay disponible una información limitada sobre la modulación de las funciones celulares por medio de la señalización de CD70 tras la interacción CD70/CD27, es 30 decir, la "señalización inversa". Algunos anticuerpos de CD70 tienen la capacidad de de aumentar la proliferación de las células T cuando se presentan a las células T que expresan CD70, entrecruzados con un anticuerpo secundario o inmovilizados en pla-cas de cultivo de tejidos (Bowman et al., 1994, J Immunol 152:1756-61; Brugnoni, 1997, Immunol Lett 55:99-104). Tal "señalización inversa" se ha descrito también en 35

un subgrupo de células de leucemia linfocítica B crónica (B-CLL), y CD70 puede fun-cionar como receptor para...

1. Un conjugado anticuerpo-fármaco que comprende un anticuerpo que se une a CD70 y que está conjugado con un agente citotóxico, para el tratamiento de un cáncer que expresa CD70 en un sujeto. 5

2. El conjugado anticuerpo-fármaco según la reivindicación 1, en el que el conjugado anticuerpo-fármaco comprende:

un anticuerpo que se une a CD70 y que está conjugado con un agente cito-tóxico, en el que (1) el conjugado anticuerpo-fármaco ejerce un efecto citotóxico sobre 10 una línea de células cancerosas que expresan CD70, y (2) el anticuerpo es un anti-cuerpo de ratón o una forma quimérica o humanizada del mismo, en el que:

(a) el anticuerpo de ratón comprende una región variable de la cadena pe-sada que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID Nº: 2 y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos 15 expuesta en SEQ ID Nº: 12; o

(b) el anticuerpo de ratón comprende una región variable de la cadena pe-sada que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID Nº: 22 y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoáci-dos expuesta en SEQ ID Nº: 32. 20

3. El conjugado anticuerpo-fármaco según la reivindicación 1, en el que el conjugado anticuerpo-fármaco comprende un anticuerpo que se une a CD70, y está conjugado con un agente citotóxico, en el que el conjugado anticuerpo-fármaco ejerce un efecto citotóxico sobre una línea de células cancerosas que expresan CD70; y en el 25 que el agente citotóxico es un agente antitubulina, un agente de unión al surco menor del ADN, un inhibidor de la replicación del ADN, un agente alquilante, antraciclina, duocarmicina, enediína, maitansinoide, alcaloide de la vinca, etopósido o inhibidor de topoisomerasas.

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4. El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 3, en el que el anticuerpo es monoclonal y es un anticuerpo de ratón, o una forma quimérica o huma-nizada del mismo, en el que:

(a) el anticuerpo de ratón comprende una región variable de la cadena pe-sada que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID Nº: 2 y una 35

región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID Nº: 12; o

(b) el anticuerpo de ratón comprende una región variable de la cadena pe-sada que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID Nº: 22 y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoáci-5 dos expuesta en SEQ ID Nº: 32.

5. El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 3, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico.

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6. El conjugado anticuerpo-fármaco de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo es multivalente.

7. El conjugado anticuerpo-fármaco de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el agente citotóxico se selecciona de un agente antitubulina, un 15 agente de unión al surco menor del ADN, un agente alquilante, una enediína, una duo-carmicina, un maitansinoide y un alcaloide de la vinca.

8. El conjugado anticuerpo-fármaco de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el agente citotóxico es un agente anti-tubulina. 20

9. El conjugado anticuerpo-fármaco de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el agente citotóxico es una auristatina.

10. El conjugado anticuerpo-fármaco de las reivindicaciones 2 ó 3, en el que 25 el anticuerpo está conjugado con el agente citotóxico por medio de un ligador.

11. El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 10, en el que el ligador es escindible en las condiciones intracelulares.

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12. El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 11, en el que el ligador escindible comprende un péptido, y en el que el ligador es escindible mediante una proteasa intracelular.

13. El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 12, en el que la proteasa intracelular es una proteasa lisosómica o una proteasa endosómica.

14. El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 12, en el que el ligador peptídico comprende un dipéptido. 5

15. El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 14, en el que el dipéptido es val-cit o phe-lys.

16. El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 11, en el que el 10 ligador escindible es hidrolizable a un pH menor de 5,5.

17. El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 16, en el que el ligador hidrolizable es un ligador de hidrazona.

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18. El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 11, en el que el ligador escindible es un ligador de disulfuro.

19. El conjugado anticuerpo-fármaco de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 18, en el que la línea de células cancerosas que expresan CD70 deriva de un carci-20 noma de células renales, un linfoma de células B o un glioblastoma.

20. El conjugado anticuerpo-fármaco de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en el que el cáncer que expresa CD70 se selecciona de un tumor de riñón, un linfoma de células B, un carcinoma tímico, un carcinoma nasofaríngeo y un tumor ce-25 rebral.

21. El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 20, en el que el tumor de riñón es un carcinoma de células renales

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22. El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 20, en el que el tumor cerebral es un glioma, un glioblastoma o un menangioma.

23. El conjugado anticuerpo-fármaco de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que el sujeto es un ser humano. 35

24. El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 2 ó 4, en el que el agente es MMAF, y el anticuerpo es quimérico o humanizado.

25. El conjugado anticuerpo-fármaco de cualquiera de las reivindicaciones 5 precedentes, en el que el agente es MMAE.

26. Un conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, para el uso en el tratamiento de un carcinoma de células renales.

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27. Una composición farmacéutica para el tratamiento de un cáncer que expresa CD70, y la composición comprende el conjugado anticuerpo-fármaco como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, y 24 ó 25 y al menos un ingre-diente farmacéuticamente compatible.