PROTEÍNAS DE UNIÓN AL FACTOR DE CRECIMIENTO DE HEPATOCITOS( HGF).

Proteína de unión aislada que se une al factor de crecimiento humano de hepatocitos (HGF),

que comprende: (a) una región variable de una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la estructura CDRH1-CDRH2-CDRH3, en la que (i) CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 15, (ii) CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº 204 y SEC ID Nº 205, y (iii) CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 17 y (b) una región variable de una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la estructura CDRL1-CDRL2-CDRL3, en la que (i) CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 18, (ii) CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº 19 y SEC ID Nº 206, y (iii) CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 20, en la que la región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina y la región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina definen conjuntamente un solo sitio de unión para la unión a HGF humano

SOLICITUDES RELACIONADAS [0001] Esta solicitud reivindica el beneficio y la prioridad respecto a las Solicitudes Provisionales de Estados Unidos Nº 60/810.714, presentada el 2 de junio de 2006, y 60/860.509, presentada el 21 de noviembre de 2006.

CAMPO DE LA INVENCIÓN [0002] El campo de la invención es la biología molecular, la inmunología y la oncología. Más particularmente, el campo son proteínas de unión basadas en anticuerpos que se unen al factor de crecimiento de hepatocitos humano (HGF).

ANTECEDENTES [0003] El factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), también conocido como factor de dispersión (SF), es una proteína heterodimérica multifuncional producida predominantemente por células mesenquimales, y es un efector de células que expresan el receptor de Met tirosina quinasa (Bottaro et al. (1991) SCIENCE 251: 802-804, Rubin et al. (1993) BIOCHIM. BIOPHYS. ACTA 1155: 357-371). El receptor de Met humano también se conoce como “c-Met”. El HGF maduro contiene dos cadenas polipeptídicas, la cadena º y la cadena º. Los estudios publicados sugieren que es la cadena º la que contiene el dominio de unión al receptor c-Met del HGF. [0004] Cuando se une a su receptor afín, el HGF media varias actividades celulares. La ruta de señalización de HGF-Met desempeña un papel en la regeneración del hígado, la cicatrización de heridas, la regeneración neuronal, la angiogénesis y tumores malignos. Véase, por ejemplo, Cao et al. (2001) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 98: 7443-7448, Burges et al. (2006) CANCER RES. 66: 1721-1729 y Patentes de los Estados Unidos Nº 5.997.868 y 5.707.624. Los investigadores han estado desarrollando varios moduladores de HGF, incluyendo anticuerpos, para tratar diversos trastornos que implican actividad de HGF, por ejemplo, ciertos cánceres sensibles a HGF. Véase, por ejemplo, la Publicación de Solicitud Internacional Nº WO 2005/017107. [0005] La estructura básica común a todos los anticuerpos se muestra esquemáticamente en la Figura 1. Los anticuerpos son proteínas multiméricas que contienen cuatro cadenas polipeptídicas. Dos de las cadenas polipeptídicas se denominan cadenas pesadas o H, y dos de las cadenas polipeptídicas se denominan ligeras o L. Las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina están

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conectadas por un enlace disulfuro intercatenario. Las cadenas pesadas de inmunoglobulina están conectadas por varios enlaces disulfuro intercatenarios. Una cadena ligera está compuesta por una región variable (VL en la Figura 1) y una región constante (CL en la Figura 1), mientras que la cadena pesada está compuesta por una región variable (VH en la Figura 1) y al menos tres regiones constantes (CH1, CH2 y CH3 en la Figura 1). Las regiones variables determinan la especificidad del anticuerpo y las regiones constantes tienen otras funciones. [0006] La información estructural y de aminoácidos indica que cada región variable comprende tres regiones hipervariables (también conocidas como regiones determinantes de la complementariedad o CDR) flanqueadas por cuatro regiones de entramado (“framework regions”) relativamente conservadas o FR. Las tres CDR, denominadas CDR1, CDR2 y CDR3 son responsables de la especificidad de unión de anticuerpos individuales. Cuando los anticuerpos se van a usar como agentes de diagnóstico y terapéuticos, típicamente es deseable crear anticuerpos que tengan la mayor especificidad y afinidad de unión hacia la molécula diana. Se cree que las diferencias en las regiones variables pueden tener un gran efecto sobre la especificidad y la afinidad del anticuerpo. [0007] En el documento WO 2005/017107 A, se describen anticuerpos contra la proteína HGF humana. La Patente de Estados Unidos Nº 5.707.624 describe el uso de anticuerpos anti-HGF en el tratamiento del sarcoma de Kaposi. De forma similar, la Patente de estados Unidos Nº 5.997.868 describe el tratamiento de un tumor por administración de un anticuerpo anti-HGF al paciente a tratar para bloquear la capacidad del HGF endógeno para promover la angiogénesis en el tumor. Más recientemente, los investigadores propusieron que los anticuerpos que se unen a la cadena º de HGF pueden tener potencial como agentes terapéuticos en pacientes con tumores dependientes de HGF (Burgess (2006), anteriormente). [0008] No obstante, todavía existe la necesidad de moduladores de HGF adicionales que puedan usarse como agentes terapéuticos y de diagnóstico.

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN [0009] La invención se basa, en parte, en el descubrimiento de una familia de proteínas de unión que se unen específicamente a HGF, en particular, HGF humano. Las proteínas de unión están basadas en anticuerpos en la medida en que contienen sitios de unión a antígeno (es decir, HGF) basados en las CDR de una familia de anticuerpos que se unen específicamente a HGF. Las CDR confieren la especificidad de unión de las proteínas de unión a HGF. Las proteínas de unión pueden usarse como agentes de diagnóstico y terapéuticos. Cuando se usan como agente terapéutico, las proteínas de unión se modifican por ingeniería genética (por ejemplo, se humanizan) para reducir o eliminar el riesgo de inducir una respuesta inmune contra la proteína de unión cuando se administran al destinatario (por ejemplo, un ser humano). [0010] Las proteínas de unión neutralizan la actividad de HGF y, por lo tanto, pueden usarse como agente terapéutico. En ciertas realizaciones, las proteínas de unión impiden la unión de HGF a su receptor afín, c-Met, neutralizando de este modo la actividad de HGF. Debido a que se ha implicado al HGF en el crecimiento y la proliferación de células cancerosas, las proteínas de unión pueden usarse para inhibir la proliferación de células cancerosas. Además, cuando se administran a un mamífero, las proteínas de unión pueden inhibir o reducir el crecimiento de un tumor en el mamífero. [0011] La invención proporciona una proteína de unión aislada que se une al factor de crecimiento de hepatocitos humano (HGF), que comprende:

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(a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la estructura CDRH1-CDRH2-CDRH3, en la que

(i) la CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 15,

(ii) la CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID Nº 204 y la SEC ID Nº 205 y

(iii) la CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 17 y

(b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la estructura CDRL1-CDRL2-CDRL3, en la que

(i) la CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 18,

(ii) la CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID Nº 19 y la SEC ID Nº 206 y

(iii) la CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 20, en la que la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina y la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina definen en conjunto un solo sitio de unión para unirse a HGF humano. [0012] La invención proporciona además un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la estructura CDRL1-CDRL2-CDRL3, en la que

(i) la CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 18,

(ii) la CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 206 y

(iii) la CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 20 y un vector de expresión que comprende dicho ácido nucleico. [0013] La invención proporciona además un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la estructura CDRH1-CDRH2-CDRH3, en la que

(i) la CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 15,

(ii) la CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID Nº 204 y la SEC ID Nº 205 y

(iii) la CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 17 y un vector de expresión que comprende dicho ácido nucleico. [0014] También se proporciona un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la estructura CDRL1CDRL2-CDRL3, en la que

(i) la CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 18,

(ii) la CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 206 y

(iii) la CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 20 y un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la estructura... [Seguir leyendo]

1. Proteína de unión aislada que se une al factor de crecimiento humano de hepatocitos (HGF), que comprende:

(a) una región variable de una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la estructura CDRH1-CDRH2-CDRH3, en la que

(i) CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 15,

(ii) CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº 204 y SEC ID Nº 205, y

(iii) CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 17 y

(b) una región variable de una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la estructura CDRL1-CDRL2-CDRL3, en la que

(i) CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 18,

(ii) CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº 19 y SEC ID Nº 206, y

(iii) CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 20, en la que la región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina y la región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina definen conjuntamente un solo sitio de unión para la unión a HGF humano.

2. Proteína de unión de la reivindicación 1, en la que la región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina comprende la estructura CDRH1-CDRH2-CDRH3, en la que

(i) CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 15,

(ii) CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 205 y

(iii) CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 17, y la región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina comprende la estructura CDRL1-CDRL2-CDRL3, en la que

(i) CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 18

(ii) CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 206, y

(iii) CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 20.

3. Proteína de unión de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en la que las regiones determinantes de complementariedad (CDR) están interpuestas entre regiones de entramado de inmunoglobulina humanas o humanizadas.

4. Proteína de unión de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la proteína de unión es un anticuerpo o un fragmento del mismo de unión a antígeno.

5. Proteína de unión de la reivindicación 4, en la que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

6. Ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de una cadena ligera de inmunoglobulina de cualquiera de las reivindicaciones 2-5.

7. Ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de una cadena pesada de inmunoglobulina de cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

8. Vector de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 6 y/o de la reivindicación 7.

9. Célula hospedadora que comprende al menos un vector de expresión que codifica una región variable de una cadena pesada y/o ligera de inmunoglobulina de cualquiera de las reivindicaciones 2-5.

10. Procedimiento de producción de un polipéptido que comprende una región variable de una cadena pesada de inmunoglobulina, comprendiendo el procedimiento:

(i) cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 9 en condiciones para que la célula hospedadora exprese el polipéptido que comprende la región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina; y

(ii) purificar el polipéptido que comprende la región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina.

11. Procedimiento de producción de un polipéptido que comprende una región variable de una cadena ligera de inmunoglobulina, comprendiendo el procedimiento:

(i) cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 9 en condiciones para que la célula hospedadora exprese el polipéptido que comprende la región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina; y

(ii) purificar el polipéptido que comprende la región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina.

12. Proteína de unión aislada de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que la proteína de unión se une al factor de crecimiento humano de hepatocitos con una kd de 4,0 x 10-5 s-1 o inferior.

13. Proteína de unión aislada de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que la proteína de unión se une al factor de crecimiento humano de hepatocitos con una KD de 20 pM o inferior.

14. Proteína de unión de la reivindicación 1, que se une al factor de crecimiento humano de hepatocitos (HGF), que comprende una región variable de una cadena ligera de inmunoglobulina y una región variable de una cadena pesada de inmunoglobulina seleccionadas del grupo que consiste en:

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(a) una región variable de una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 193 y una región variable de una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 183;

(b) una región variable de una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 193 y una región variable de una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 189;

(c) una región variable de una cadena ligera inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 199, y una región variable de una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 183; y

(d) una región variable de una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 199 y una región variable de una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 189.

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15. Proteína de unión de la reivindicación 14, en la que la región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 199, y la región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 189.

16. Proteína de unión de la reivindicación 1, que se une al factor de crecimiento humano de hepatocitos (HGF), que comprende una secuencia de una cadena ligera de inmunoglobulina y una secuencia de una cadena pesada de inmunoglobulina seleccionadas del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 197 y una secuencia de una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 187;

(b) una secuencia de una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 197 y una secuencia de una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 191;

(c) una secuencia de una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 201 y una secuencia de una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 187; y

(d) una secuencia de una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 201 y una secuencia de una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 191.

17. Proteína de unión de la reivindicación 16, en la que la cadena ligera de inmunoglobulina comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 201 y la cadena pesada de inmunoglobulina comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 191.

18. Proteína de unión de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 ó 14-17 para su uso en terapia.

19. Proteína de unión de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 ó 14-17 para su uso en la inhibición o reducción de la proliferación de una célula tumoral.

20. Proteína de unión de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 ó 14-17 para su uso en la inhibición o reducción del crecimiento tumoral en un mamífero.

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5 21. Procedimiento de producción de una proteína de unión que se une al factor de crecimiento humano de hepatocitos (HGF), que es un anticuerpo intacto, tal como un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprendiendo el procedimiento:

(i) hacer crecer la célula hospedadora de la reivindicación 9 en condiciones

10 que permitan que la célula hospedadora exprese un polipéptido que comprende la región variable de una cadena pesada de inmunoglobulina y un polipéptido que comprende la región variable de una cadena ligera de inmunoglobulina; y

(ii) purificar el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del anticuerpo. 15