PROCESO DE CLONACIÓN LIMPIA.

Un proceso de inserción de una secuencia de ácido nucleico de interés en un ácido nucleico aceptor,

que comprende las etapas siguientes: amplificar por PCR un ADN que comprende, en el siguiente orden, un segmento de secuencia U, un segmento de secuencia de ácido nucleico de secuencia de nucleótidos conocida K2 y un segmento de secuencia de ácido nucleico de secuencia conocida K3, usando un cebador directo que define un primer extremo del ADN amplificado y un cebador inverso que define un segundo extremo del ADN amplificado, terminando dicho cebador inverso en su extremo 3' en una secuencia de nucleótidos de segmentos de secuencia de ácido nucleico K3; tratar las moléculas de ADN bicatenario lineal contenidas en el producto de PCR obtenido en la etapa anterior con una exonucleasa para obtener un saliente monocatenario en el primer extremo del ADN y un saliente monocatenario que comprende los segmentos de ácido nucleico K2 y K3 en el segundo extremo del ADN; hibridar el producto de la etapa anterior con un ácido nucleico aceptor bicatenario linealizado que tiene en un primer extremo del mismo un saliente monocatenario complementario al saliente monocatenario del primer extremo del ADN y, en un segundo extremo del mismo, un saliente monocatenario complementario al segmento de secuencia monocatenario K2 del segundo extremo del ADN; y usar el producto de reacción obtenido en la etapa anterior para transformar una célula hospedadora

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E08017649.

Solicitante: ICON GENETICS GMBH.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: BRIENNERSTRASSE 12A 80333 MUNCHEN ALEMANIA.

Inventor/es: WEBER, ERNST, MARILLONNET,SYLVESTRE, ENGLER,CAROLA, Kandzia,Romy, Thieme,Frank.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 8 de Octubre de 2008.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N15/64 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Métodos generales para la preparación del vector, para su introducción en la célula o para la selección del huésped que contiene el vector.
  • C12N15/66 C12N 15/00 […] › Métodos generales para insertar un gen en un vector para formar un vector recombinante, utilizando la escisión y la unión; Utilización de "linkers" no funcionales o de adaptadores, p. ej. "linkers" que contienen la secuencia para una endonucleasa de restricción.

Clasificación PCT:

  • C12N15/09 C12N 15/00 […] › Tecnología del ADN recombinante.
  • C12N15/10 C12N 15/00 […] › Procedimientos para el aislamiento, la preparación o la purificación de ADN o ARN (preparación química de ADN o ARN C07H 21/00; preparación de polinucleótidos no estructurales a partir de microorganismos o con la ayuda de enzimas C12P 19/34).

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.

PDF original: ES-2364920_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un proceso de clonación de una secuencia de ácido nucleico que flanquea a una secuencia de ácido nucleico de secuencia de nucleótidos conocida en ADN genómico o ARN. La invención también se refiere a un proceso de inserción de una secuencia de ácido nucleico de interés, que puede ser de secuencia de nucleótidos desconocida, en un ácido nucleico aceptor o vector aceptor. La secuencia de ácido nucleico de secuencia de nucleótidos desconocida puede secuenciarse después de la etapa de inserción o clonación, por ejemplo, para determinar la localización de la secuencia de ácido nucleico de secuencia de nucleótidos conocida en el genoma.

Antecedentes de la invención

Desde su desarrollo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha revolucionado el campo de la biología molecular. La PCR es un proceso por el que cualquier secuencia de ADN de interés (de un tamaño razonable) localizada entre dos secuencias conocidas puede amplificarse usando dos cebadores homólogos a estas dos secuencias conocidas, siendo un cebador un cebador directo y siendo el otro cebador (que se une a la cadena complementaria) un cebador inverso. La PCR permite clonar fácilmente cualquier secuencia de interés, con tal de que estén disponibles dos secuencias flanqueantes conocidas. No es necesario ningún conocimiento de la secuencia localizada entre los dos sitios de unión a cebador.

Un problema relacionado aunque diferente en la biología molecular es la identificación de secuencias desconocidas que flanquean a una región de secuencia de nucleótidos conocida. La PCR no puede usarse directamente para amplificar un fragmento que contiene la secuencia conocida y desconocida, puesto que se conoce la secuencia en sólo un extremo del fragmento a amplificar. Los ejemplos de problemas de este tipo incluyen la determinación de la secuencia de nucleótidos que flanquea a un transgén integrado de forma estable (por ejemplo, en un ADN-T), la secuencia de nucleótidos que flanquea a una inserción de transposón, o la secuencia de nucleótidos de la región variable de un anticuerpo para el que sólo se conoce el isotipo. Los dos primeros ejemplos se refieren a moléculas de ADN, mientras que el tercer ejemplo se refiere a moléculas de ARN. Esta diferencia no es importante ya que las moléculas de ARN pueden convertirse en ADNc por transcripción inversa usando un cebador que se una a la región conocida.

Con los años, se han desarrollado muchos protocolos para proporcionar soluciones para identificación de secuencias desconocidas que flanquean a secuencias conocidas. Muchos de estos protocolos usan la unión de un adaptador al extremo de la secuencia desconocida o usan una PCR que usa uno o varios cebadores inespecíficos (cebadores que contienen de hecho tanto una secuencia constante conocida, una secuencia adaptadora, seguida de una secuencia variable inespecífica o aleatoria) que se unen aleatoriamente al ADN, incluyendo a secuencias en las proximidades de la secuencia conocida. Después se realizan dos o tres PCR usando combinaciones de cebadores adaptadores y cebadores específicos de región conocida (o cebadores específicos de gen, abreviados en la presente memoria mediante “gsp”). Después de la primera PCR, se obtienen típicamente productos tanto específicos como inespecíficos. La proporción de productos específicos aumenta en la segunda PCR realizada usando un cebador adaptador y un cebador específico de secuencia conocida anidado, pero todavía están presentes muchos productos inespecíficos. La identificación de la secuencia desconocida puede realizarse secuenciando el producto amplificado. Sin embargo, si se espera que se amplifiquen en la misma amplificación varios productos específicos (por ejemplo, un genoma podría contener varios transgenes o varios transposones, o una población de ARN podría contener un gran número de anticuerpos diferentes), la secuenciación directa no será útil. Más bien, el producto amplificado tendrá que clonarse y los plásmidos recombinantes secuenciarse individualmente.

Hay muchas estrategias para la clonación de productos de PCR. La clonación se realiza típicamente ligando entre sí fragmentos de ADN que se han preparado por digestión con enzimas de restricción de tipo II. Este proceso requiere habitualmente varias etapas: (1) los plásmidos (o productos de PCR) que contienen el fragmento a subclonar o el vector receptor se digieren con una o dos enzimas de restricción, (2) los fragmentos digeridos se separan usando electroforesis en gel y, después, los fragmentos deseados se extraen del gel, (3) los fragmentos de vector purificado e inserto se ligan entre sí usando una ADN ligasa tal como la ADN ligasa T4, (4) la ligación se usa para transformar células de E. coli competentes.

Una limitación de técnicas de clonación convencionales es que los sitios de restricción seleccionados para la clonación no deben estar presentes dentro del fragmento a clonar. Puesto que para el problema analizado en la presente memoria, no se conoce una parte de la secuencia a clonar, puede esperarse que el uso de enzimas de restricción para la clonación dé como resultado la pérdida de parte de la secuencia de algunos de los fragmentos amplificados, o incluso impida completamente la clonación de algunos de los productos.

Se ha desarrollado una estrategia de clonación totalmente diferente que no requiere enzimas de restricción: esta estrategia depende de la generación de extremos de ADN que son monocatenarios tanto en el inserto de ADN como en el vector. Los salientes monocatenarios complementarios en el inserto de ADN y en el vector de clonación hibridarán. Si la región hibridada es de más de 12-15 nucleótidos y los dos extremos de un inserto lineal hibridan con los dos extremos de un vector plasmídico linealizado, puede conseguirse una clonación sin ligación. Las células hospedadoras tales como células de E. coli transformadas con el producto hibridado repararán las mellas, conduciendo a la formación de un plásmido circular capaz de replicarse (Li y Evans, 1997, Nucleic Acids Res., 25, 4165-4166).

Uno de los primeros métodos de clonación que se desarrollaron basándose en este principio fue la clonación con UDG. Se realizó la amplificación por PCR de un fragmento de ADN usando cebadores que contenían una extensión de 12 nucleótidos arbitrarios que contenían al menos 4 uracilos. El vector también se amplificó por PCR usando cebadores que contenían una extensión de 12 nucleótidos complementaria a la extensión en los cebadores para el inserto. Después de la amplificación por PCR, el inserto y el vector se trataron con uracilo ADN glicosilasa, que abre las extensiones de ADN en el vector y en el inserto (la UDG cataliza la hidrólisis del enlace N-glicosílico entre el uracilo y el azúcar), creando extremos de ADN monocatenarios. Después de hibridar el vector y el inserto, la mezcla se usó para transformar E. coli usando células químicamente competentes. Después, las E. coli recortan y reparan los extremos en el sitio de unión (Nisson P. E., Rashtchian A., y Watkins P. C., 1991, PCR Methods Appl., 1: 120123).

La ventaja de esta estrategia es que es eficaz y da como resultado muy pocas construcciones de vectores vacíos. Los inconvenientes son que (1) los cebadores que contienen uracilo son caros, (2) el vector completo tiene que amplificarse por PCR y (3) la extensión de cebadores tiene que contener 4 uracilos y 4 adeninas (complementarias a los uracilos en la extensión del fragmento complementario) y, por lo tanto, no puede consistir en cualquier secuencia de 12 nucleótidos de elección.

Otra estrategia desarrollada todavía anteriormente, la clonación independiente de ligación (LIC), se desarrolló basándose en la actividad exonucleasa de 3' a 5' de la polimerasa T4 (Aslanidis C. y de Jong, P. J., 1990, Nucleic Acids Res., 18: 6069-6074). Como con la clonación con UDG, se amplifica un fragmento de PCR con dos cebadores que contienen extensiones de 12 nucleótidos, careciendo estas extensiones de uno de los 4 nucleótidos, por ejemplo G. Este fragmento amplificado se trata después con polimerasa T4 en un tampón que contiene dGTP pero ninguno de los otros nucleótidos. La actividad exonucleasa de 3' a 5' de la polimerasa T4 elimina todos los nucleótidos hasta que se encuentra la primera G, punto en el cual se detiene puesto que se obtiene un equilibrio entre eliminación e incorporación de este nucleótido. Por lo tanto, este tratamiento crea una extensión monocatenaria de 12 nt (nt representa nucleótido en la presente memoria) que puede usarse para la... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un proceso de inserción de una secuencia de ácido nucleico de interés en un ácido nucleico aceptor, que comprende las etapas siguientes:

amplificar por PCR un ADN que comprende, en el siguiente orden, un segmento de secuencia U, un segmento de secuencia de ácido nucleico de secuencia de nucleótidos conocida K2 y un segmento de secuencia de ácido nucleico de secuencia conocida K3, usando un cebador directo que define un primer extremo del ADN amplificado y un cebador inverso que define un segundo extremo del ADN amplificado, terminando dicho cebador inverso en su extremo 3' en una secuencia de nucleótidos de segmentos de secuencia de ácido nucleico K3;

tratar las moléculas de ADN bicatenario lineal contenidas en el producto de PCR obtenido en la etapa anterior con una exonucleasa para obtener un saliente monocatenario en el primer extremo del ADN y un saliente monocatenario que comprende los segmentos de ácido nucleico K2 y K3 en el segundo extremo del ADN;

hibridar el producto de la etapa anterior con un ácido nucleico aceptor bicatenario linealizado que tiene en un primer extremo del mismo un saliente monocatenario complementario al saliente monocatenario del primer extremo del ADN y, en un segundo extremo del mismo, un saliente monocatenario complementario al segmento de secuencia monocatenario K2 del segundo extremo del ADN; y

usar el producto de reacción obtenido en la etapa anterior para transformar una célula hospedadora.

2. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además generar un molde para dicha PCR, que comprende unir una secuencia de unión a cebador a una secuencia de ácido nucleico que comprende, en el siguiente orden, el segmento de secuencia de ácido nucleico U, un segmento de secuencia de ácido nucleico de secuencia conocida K2 y un segmento de secuencia de ácido nucleico de secuencia conocida K3, hibridando dicho cebador directo con la secuencia de unión a cebador.

3. El proceso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la secuencia de unión a cebador es un segmento de secuencia de nucleótidos homooligomérica unido usando una desoxirribonucleótido transferasa terminal.

4. El proceso de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3, en el que dicho cebador directo comprende un segmento de secuencia adaptadora y un segmento de secuencia complementario a la secuencia de unión a cebador.

5. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además generar un molde para dicha PCR, que comprende unir una secuencia adaptadora a una secuencia de ácido nucleico que comprende, en el siguiente orden, el segmento de secuencia de ácido nucleico U en el primer extremo de la secuencia de ácido nucleico, un segmento de secuencia de ácido nucleico de secuencia conocida K2 y un segmento de secuencia de ácido nucleico de secuencia conocida K3.

6. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho ácido nucleico aceptor no contiene una porción de secuencia complementaria al segmento de secuencia monocatenario K3 en el saliente monocatenario en el segundo extremo del ácido nucleico aceptor.

7. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la exonucleasa es ADN polimerasa T4 de E. coli, el fragmento grande de la polimerasa I fragmento grande de E. coli (como polimerasa Klenow), nucleasa lambda, nucleasa T7 o exonucleasa III, preferentemente es la ADN polimerasa T4 de E. coli.

8. El proceso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7, en el que se realiza una etapa de preamplificación por PCR antes de dicha reacción de PCR definida en la reivindicación 1, usando un cebador directo que define el primer extremo del producto de PCR de la etapa de preamplificación, y un cebador inverso que termina en su extremo 3' en una secuencia de nucleótidos de segmento de secuencia de ácido nucleico K3.

9. El proceso de acuerdo con la reivindicación 2 ó 5, en el que la etapa de unión se realiza en una mezcla que comprende ADN genómico aislado a partir de células eucariotas o procariotas.

10. El proceso de acuerdo con la reivindicación 2 ó 5, en el que dicha etapa de unión se realiza en el extremo 3' de un ADNc retro transcrito a partir de un ARNm.

11. Un proceso de inserción de un ADNc de una secuencia de ARN de interés en un ácido nucleico aceptor, que comprende las etapas siguientes:

aislar ARN de una célula;

retrotranscribir el ARN para formar una cadena no codificante de ADNc; amplificar por PCR dicho ADNc que comprende, en el siguiente orden, un segmento de secuencia U, un segmento de secuencia de ácido nucleico de secuencia conocida K2 y un segmento de secuencia de ácido nucleico de secuencia conocida K3, usando un cebador directo que define un primer extremo del ADN amplificado y un cebador inverso que define un segundo extremo del ADN amplificado, terminando dicho cebador inverso en su extremo 3' en una secuencia de nucleótidos de segmento de secuencia K3;

tratar las moléculas de ADN bicatenario lineal contenidas en el producto de PCR obtenido en la etapa anterior con una exonucleasa para obtener un saliente monocatenario en el primer extremo del ADN y un saliente monocatenario que comprende los segmentos de ácido nucleico K2 y K3 en el segundo extremo del ADN;

hibridar el producto de la etapa anterior con un ácido nucleico aceptor bicatenario linealizado que tiene en un primer extremo del mismo un saliente monocatenario complementario al saliente monocatenario del primer extremo del ADN, y en un segundo extremo del mismo un saliente monocatenario complementario al segmento de secuencia monocatenaria K2 del segundo extremo del ADN; y

transformar el producto de reacción obtenido en la etapa anterior en una célula hospedadora.

12. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la secuencia de interés comprende en dirección 5' a 3' un segmento de secuencia U, un segmento de secuencia K2 de secuencia de nucleótidos conocida y un segmento de secuencia K3 de secuencia de nucleótidos conocida.

13. El proceso de acuerdo con la reivindicación 11, que comprende proporcionar un molde para dicha PCR por unión de una secuencia de unión a cebador al extremo 3' de dicho ADNc, en el que el cebador directo usado en dicha PCR hibrida con dicha secuencia de unión a cebador.

14. El proceso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el ARN es ARNm.

15. El proceso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el ARN codifica una cadena de inmunoglobulina, la secuencia U es parte de una región variable de la inmunoglobulina y las secuencias K2 y K3 conocidas son parte de una región constante de la inmunoglobulina.

 

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