Un procedimiento de producción en una planta, tejido vegetal o células vegetales de una proteína heterooligomérica que comprende al menos una primera y una segunda subunidad proteica,

comprendiendo dicho procedimiento expresar en células vegetales al menos dicha primera y dicha segunda subunidad proteica proporcionando a dicha planta, dicho tejido vegetal o dichas células vegetales un primer y un segundo vector viral de ARN de cadena sencilla de sentido positivo, codificando dicho primer vector viral al menos dicha primera subunidad proteica, codificando dicho segundo vector viral al menos dicha segunda subunidad proteica, por lo que dicho primer vector viral y dicho segundo vector viral son

(a) vectores virales no competitivos ya que no se obtienen de virus de la misma especie de virus;

(b) vectores virales no competitivos ya que difieren en partes de secuencia diferentes de las partes de secuencia que codifican dicha primera y dicha segunda subunidad proteica;

(c) vectores virales no competitivos ya que el o los ORF de replicasa de dicho primer vector viral y el o losORF de replicasa de dicho segundo vector viral tienen una homología como máximo del 90%; o

(d) vectores virales no competitivos ya que el o los ORF de replicasa de dicho primer vector viral y el o los ORF de replicasa de dicho segundo vector viral tienen una identidad como máximo del 85%.

Producción de anticuerpos en plantas con vectores virales de ARN de cadena sencilla, de sentido positivo

5 Campo de la invención

La presente invención se refiere a la producción de proteínas hetero-oligoméricas en plantas, partes de plantas o cultivos de células vegetales utilizando vectores virales de ARN de cadena sencilla de sentido positivo. El procedimiento y los vectores descritos en la presente invención proporcionan células vegetales con un rendimiento aumentado de proteína recombinante hetero-oligomérica funcional, tal como un anticuerpo de longitud completa o derivados sintéticos hetero-oligoméricos de los mismos que incluyen fusiones con otras proteínas o sus fragmentos.

Antecedentes de la invención

La agricultura molecular basada en plantas es una oportunidad atractiva para la producción de proteínas recombinantes destinadas a ser utilizadas en el campo de la salud humana y animal, preferiblemente debido a los potencialmente bajos costes de producción y los intentos de la industria biofarmacéutica de eliminar proteínas obtenidas de animales de los procedimientos de fabricación debido a la posible contaminación de estos productos con patógenos humanos, tales como la Encefalopatía Espongiforme Bovina (EEB) o enfermedad de Creuzfeld-Jacob (CJD, vCJD) . No obstante, la producción de alto rendimiento de proteínas hetero-oligoméricas en células vegetales es un problema que no se puede resolver con la ayuda de sistemas de expresión convencionales basados en el uso de promotores constitutivos fuertes o específicos de tejido por las siguientes razones: en primer lugar, la mayoría de tales proteínas recombinantes tienen un efecto perjudicial sobre el crecimiento y desarrollo de la planta, perjudicando por lo tanto fuertemente el rendimiento; en segundo lugar, el uso de promotores específicos de tejido (por ejemplo, específicos de semilla) requeriría la incorporación estable de genes que codifican proteínas farmacéuticas en los genomas de plantas de cultivo comestibles (por ejemplo, arroz, maíz, trigo) , lo cual puede generar problemas con el control de flujo de transgenes en caso de un cultivo en campo abierto. Además, estos sistemas no son viables comercialmente si se utilizan en ambiente cerrado (invernadero) debido al bajo rendimiento del producto.

Los sistemas de expresión transitorios basados en virus vegetales (para una revisión véase: Porta & Lomonossoff, 1996, Mol. Biotechnol., 5, 209-221; Yusibov et al., 1999, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 240, 81-94; Gleba et al., 2004, Curr. Opin. Plant Biol., 7, 182-188) son capaces de proporcionar altos niveles de expresión en tejidos de hojas de plantas y en cierta medida son capaces de abordar los problemas de citotoxicidad de proteínas recombinantes y 35 su efecto perjudicial en el desarrollo de plantas, dado que la tecnología permite separar los estadios de crecimiento y producción. Los sistemas mejor establecidos y viables comercialmente se basan en vectores virales de ARN de cadena sencilla, de sentido positivo, de manera preferible en vectores obtenidos del Virus del Mosaico del Tabaco (TMV) (Kumagai et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 427-430; Mallor y et al., 2002, Nature Biotechnol. 20, 622-625; documentos US5316931; US5589367; US5866785; US5977438; WO2088369; WO02097080; WO0229068; US5491076) . No obstante, estos sistemas adolecen de limitaciones graves que restringen su uso a la producción de proteínas sencillas relativamente pequeñas. En parte, esto está causado por la inestabilidad de los vectores virales y la alta frecuencia de su reversión al tipo silvestre, si llevan secuencias heterólogas mayor de 1 kb. Además, una limitación grave de la tecnología es la ausencia de sistemas de vector viral capaces de expresar proteínas hetero-oligoméricas complejas como anticuerpos monoclonales terapéuticos y sus derivados que 45 representan el grupo más valioso de proteínas recombinantes.

Existe únicamente una publicación que aborda la expresión de un anticuerpo monoclonal de longitud completa en plantas utilizando vectores virales vegetales (Verch et al., 1998, J. Immunol. Meth., 220, 69-75) . Esta investigación describe el uso de dos vectores virales basados en TMV sistémicos para la expresión de las cadenas pesada y ligera de anticuerpo monoclonal en hojas sistémicas, por lo que se expresan las diferentes cadenas a partir de vectores diferentes después de co-infección de plantas de N. benthamiana con transcritos sintetizados in vitro de dichos vectores. No obstante, el rendimiento de proteína recombinante en dicho sistema es tan bajo que la presencia de anticuerpo monoclonal ensamblado debe confirmarse con pruebas altamente sensibles como transferencia de Western y ELISA. Debido al rendimiento despreciable de anticuerpo recombinante, este sistema no 55 es adecuado para aplicaciones prácticas y no tiene valor comercial. Dado que dos o más vectores virales basados en TMV normalmente no están presentes en los mismos tejidos vegetales de una planta infectada (véase ejemplo 1) , la actividad de unión de antígeno detectada puede deberse a anticuerpo que se ha ensamblado in vitro durante el procedimiento de aislamiento de las cadenas de anticuerpo pesada y ligera que se expresan en células o en tejido separados. Previamente se ha demostrado que los anticuerpos funcionales se pueden ensamblar in vitro a partir de componentes de anticuerpo desnaturalizados y reducidos (Petersen & Dorrington, 1974, J. Biol. Chem., 17, 56335641; Maeda et al., 1996, Protein Engineering, 9, 95-100) . No obstante, la eficiencia de tal ensamblaje en ausencia de condiciones favorables para tal ensamblaje es muy baja.

Por lo tanto, no existe un sistema de expresión a gran escala para proteínas hetero-oligoméricas recombinantes en 65 plantas, cuyo rendimiento y eficiencia pueda ser suficiente para competir en el mercado con otros sistemas de expresión a gran escala como los sistemas de expresión fúngicos o de células de insecto. Tal expresión en planta puede necesitar satisfacer los siguientes criterios tan bien como sea posible:

(i) alto rendimiento, incluyendo la expresión de la proteína hetero-oligomérica de interés en tantos tejidos vegetales como sea posible y en muchas células de dichos tejidos;

(ii) para evitar un efecto perjudicial de la expresión de proteína recombinante en el crecimiento de la planta, la expresión de la proteína o producto de interés debe ser transitoria (o conmutable) de manera que la expresión se pueda iniciar en un estadio deseado del desarrollo de la planta;

(iii) proporcionar una relación óptima de poliproteínas que codifican diferentes subunidades proteicas heterooligomérica en una célula vegetal, respaldando por tanto el alto rendimiento de proteína recombinante a nivel de dicho ensamblaje de proteína recombinante a partir de dichas subunidades.

Por lo tanto, un objetivo de esta invención es proporcionar un procedimiento eficaz para producir una proteína hetero-oligomérica en una planta, una parte de una planta o un cultivo de células vegetales. Un objetivo adicional es el suministro de un sistema de expresión vegetal de alto rendimiento capaz de expresar proteína hetero-oligomérica.

Otro objetivo de la invención es proporcionar un procedimiento eficaz para la co-expresión de más de un polipéptido de interés en la misma célula vegetal. Además, un objetivo de la invención es proporcionar un método rápido y de alto rendimiento para expresar anticuerpos en una planta, parte de una planta o en un cultivo de células vegetales.

Descripción general de la invención

La invención proporciona un procedimiento para la producción en una planta, un tejido de planta o en células vegetales de una proteína hetero-oligomérica que comprende al menos una primera y una segunda subunidad proteica, comprendiendo dicho procedimiento expresar en células vegetales al menos dicha primera y dicha segunda subunidad proteica mediante:

(i) el suministro a dicha planta, dicho tejido vegetal o a dichas células vegetales de un primer y un segundo vector viral de ARN de cadena sencilla, de sentido positivo, codificando dicho primer vector viral al menos dicha primera subunidad proteica, codificando dicho segundo vector viral al menos dicha segunda subunidad proteica, por lo que al menos dicho primer vector viral y dicho segundo vector viral son vectores virales no competitivos como se definen en la reivindicación 1. También se describe un procedimiento que comprende expresar en células vegetales al menos dicha primera y dicha segunda subunidad proteica mediante

(ii) el suministro a... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de producción en una planta, tejido vegetal o células vegetales de una proteína heterooligomérica que comprende al menos una primera y una segunda subunidad proteica, comprendiendo dicho procedimiento expresar en células vegetales al menos dicha primera y dicha segunda subunidad proteica proporcionando a dicha planta, dicho tejido vegetal o dichas células vegetales un primer y un segundo vector viral de ARN de cadena sencilla de sentido positivo, codificando dicho primer vector viral al menos dicha primera subunidad proteica, codificando dicho segundo vector viral al menos dicha segunda subunidad proteica, por lo que dicho primer vector viral y dicho segundo vector viral son

(a) vectores virales no competitivos ya que no se obtienen de virus de la misma especie de virus;

(b) vectores virales no competitivos ya que difieren en partes de secuencia diferentes de las partes de secuencia que codifican dicha primera y dicha segunda subunidad proteica;

(c) vectores virales no competitivos ya que el o los ORF de replicasa de dicho primer vector viral y el o los 15 ORF de replicasa de dicho segundo vector viral tienen una homología como máximo del 90%; o (d) vectores virales no competitivos ya que el o los ORF de replicasa de dicho primer vector viral y el o los ORF de replicasa de dicho segundo vector viral tienen una identidad como máximo del 85%.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, seguido por el aislamiento de dicha proteína heterooligomérica de dicha planta, dicho tejido vegetal o dichas células vegetales.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que dicho primer vector viral contiene una primera secuencia heteróloga que codifica dicha primera subunidad proteica y dicho segundo vector viral contiene una segunda secuencia heteróloga que codifica dicha segunda subunidad proteica, por lo que la expresión de dicha

primera y/o dicha segunda subunidad proteica está bajo el control de un promotor subgenómico.

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que dicho primer vector viral contiene una primera secuencia heteróloga que codifica dicha primera subunidad proteica y dicho segundo vector viral contiene una segunda secuencia heteróloga que codifica dicha segunda subunidad proteica, por lo que la expresión de dicha primera y/o dicha segunda subunidad proteica está bajo el control de un elemento IRES.

5. El procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho primer vector viral y/o dicho segundo vector viral carece o carecen de un ORF de proteína de envuelta funcional, un ORF de proteína de movimiento funcional y/o un origen funcional de ensamblaje de partícula viral.

6. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho primer vector viral se obtiene de un virus que pertenece al género Potexvirus y dicho segundo vector viral se obtiene de un virus que pertenece al género Potyvirus.

7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicho primer vector viral se obtiene de Virus X de Patata y dicho segundo vector viral se obtiene del Virus Y de Patata.

8. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho primer vector viral

se obtiene de un virus que pertenece al género Potexvirus y dicho segundo vector viral se obtiene de un virus que 45 pertenece al género Tobamovirus.

9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que dicho primer vector viral se obtiene del Virus X de Patata y dicho segundo vector viral se obtiene del Virus del Mosaico del Tabaco.

10. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho primer y dicho segundo vector viral tienen como máximo el 60% de homología de secuencia.

11. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicha proteína heteri oligomérica es un anticuerpo. 55

12. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho o dichos vectores virales se proporcionan de manera transitoria a dicha planta, tejido vegetal o células vegetales.

13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que dicho o dichos vectores virales se proporcionan de manera transitoria a dicha planta, tejido vegetal o células vegetales por transfección con Agrobacterium.

14. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho o dichos vectores virales de ARN se incorporan de manera estable en el ADN cromosómico de la planta como precursores de ADN de dichos vectores virales de ARN.

15. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en el que la liberación controlada de dicho o dichos

vectores virales de ARN de dichos precursores de ADN se proporciona por promotores inducibles.

16. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que al menos dicha primera

o dicha segunda subunidad proteica tiene un péptido señal específico de planta como una señal de direccionamiento 5 de ER.

17. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16, en el que dichos péptidos señal específicos de planta se obtienen de calreticulina de tabaco y/o alfa-amilasa de arroz.

18. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que dicho anticuerpo es una inmunoglobulina que comprende al menos una parte de un dominio de unión a antígeno.

19. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11 o 18, en el que dicho anticuerpo comprende una proteína

de protección en asociación con una cadena pesada de inmunoglobulina, en el que la proteína de protección 15 comprende una parte de un receptor de poliinmunoglobulina.

20. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11, 18 o 19, en el que dicho anticuerpo o su derivado pertenece a la clase de inmunoglobulina G, a la clase de inmunoglobulina A, a la clase de inmunoglobulina M, a la clase de inmunoglobulina D o a la clase de inmunoglobulina E.

21. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha proteína heterooligomérica es insulina.

22. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que al menos una o al

menos dos o más subunidades de dicha proteína hetero-oligomérica contiene una señal de retención en retículo endoplásmico KDEL.

23. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que dichas secuencias de ácido nucleico heterólogas se mutan con el fin de eliminar parcial o completamente los sitios de glucosilación de dicha proteína hetero-oligomérica.

24. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 23, en el que dicha planta, tejido vegetal o célula vegetal se modifica por ingeniería genética para alterar el patrón de glucosilación de dicha proteína heterooligomérica.

25. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en el que dicha planta es una planta monocotiledónea o dicotiledónea.

26. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 25, en el que dicha planta dicotiledónea pertenece a la familia Solanacea.

27. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 25, en el que dicha planta dicotiledónea es una especie de Nicotiana.

45 28. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 25, en el que dicha planta dicotiledónea es Nicotiana tabacum

o Nicotiana benthamiana.

29. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 25, en el que dicha planta dicotiledónea pertenece a la familia Brassicacea.

30. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 25, en el que dicha planta dicotiledónea pertenece a la familia de las leguminosas.

31. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 25, en el que dicha planta dicotiledónea es Medicago sativa. 55

32. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 25, en el que dicha planta dicotiledónea pertenece a la familia Chenopodiaceae.

33. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 25, en el que dicha planta dicotiledónea es Beta vulgaris.

34. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33, comprendiendo dicho procedimiento proporcionar a dicha planta, dicho tejido vegetal o dichas células vegetales por transfección mediada por Agrobacterium un precursor de ADN de dicho primer vector viral de ARN de cadena sencilla de sentido positivo y un precursor de ADN de dicho segundo vector viral de ARN de cadena sencilla de sentido positivo, por lo que al

65 menos dicho primer vector viral o dicho segundo vector viral carecen de un marco de lectura abierto que codifica una proteína funcional necesaria para movimiento sistémico de dicho primer o dicho segundo vector viral en dicha planta.