Un ácido nucleico que comprende o que codifica un replicón de ARN que comprende,

en este orden, los siguientessegmentos (i) a (iii):

(i) una secuencia de ácido nucleico que codifique una ARN polimerasa dependiente de ARN de potexvirus o unavariante conservadora de la función de la misma; en la que dicha secuencia del punto (i) codifica una proteína quetiene una identidad de secuencia de al menos 36% con una proteína codificada por la SEC ID NO:4 dentro de unsegmento de secuencia de proteína de al menos 300 restos aminoacídicos;

(ii) una secuencia de ácido nucleico que comprenda:

(a) un bloque genético triple de potexvirus o una variante conservadora de la función del mismo, en el quedicha variante conservadora de la función de dicho bloque genético triple de potexvirus codifica las tresproteínas siguientes:

una primera proteína que comprende un segmento de secuencia de proteína de al menos 200 restosaminoacídicos, teniendo dicho segmento de secuencia de proteína una identidad de secuencia al menos40% con un segmento de secuencia de la SEC ID NO:10; una segunda proteína que comprende unsegmento de secuencia de proteína de al menos 100 restos aminoacídicos, teniendo dicho segmento desecuencia de proteína una identidad de secuencia de al menos 40% con un segmento de secuencia de laSEC ID NO:12; y una tercera proteína que comprende un segmento de secuencia de proteína de al menosrestos aminoacídicos, teniendo dicho segmento de secuencia de proteína una identidad de secuencia deal menos 40% con un segmento de secuencia de la SEC ID NO:14; y

(b) una secuencia que codifique una proteína de recubrimiento potexviral o una variante conservadora de lafunción de la misma; o una secuencia que codifique una proteína de movimiento tobamoviral; en la quedicha variante conservadora de la función de dicha proteína de recubrimiento tobamoviral comprende unsegmento de secuencia de proteína de al menos 200 restos aminoacídicos, teniendo dicho segmento desecuencia una identidad de al menos 35% con un segmento de secuencia de la SEC ID NO: 8; y

(iii) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que puede expresarse a partir de dicho replicón en una planta o enun tejido de plantao una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia complementaria de dicho ácido nucleico.

Replicón derivado de potexvirus

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un proceso de expresión de alta producción de un gen de interés en una planta, en tejido de planta o en células de planta usando un replicón derivado de potexvirus y a un ácido nucleico que comprende o que codifica un replicón de ARN potexviral que puede utilizarse para expresar un gen de interés. La invención también se refiere a un kit de partes que comprende dos o más vectores que juntos codifican el replicón de ARN de la invención.

Antecedentes de la invención

La expresión de alta producción de proteínas heterólogas en plantas puede lograrse usando vectores virales. Los sistemas de vectores viral se desarrollaron predominantemente para la expresión transitoria seguida por la infección (Donson et al., 1991, Proc Natl Acad Sci USA, 88:7204-7208; Chapman, Kavanagh & Baulcombe, 1992, Plant J., 2:549557) o la transfección (Marillonnet et al., 2005, Nat Biotechnol., 23:718-723; Santi et al., 2006, Proc Natl Acad Sci U S A. 103:861-866; documento WO02005/049839) de un huésped de planta. Los sistemas mejor establecidos y comercialmente disponibles se basan en virus de ARN monocatenario de sentido positivo, preferiblemente en vectores derivados del Virus del Mosaico del tabaco (TMV) (Kumagai et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 427-430; Mallor y et al., 2002, Nature Biotechnol. 2O, 622-625; documentos US5316931; US5589367; US5866785; US5977438; WO02088369; WO02097080; WO0229068; US5491076) .

Otro grupo de vectores basados en virus de ARN derivados del potexvirus PVX (virus X de la patata) también puede proporcionar una producción razonablemente alta de proteínas recombinantes, aunque una producción notablemente menor que los vectores derivados del TMV (Chapman, Kavanagh & Baulcombe, 1992, Plant J., 2:549-557; Baulcombe, Chapman & Santa Cruz, 1995, Plant J., 7:1045-1053; Zhou et al., 2006, Appl. Microbiol. Biotechnol., 13 Abril, Pub antes de impresión; Zelada et al., 2006, Tuberculosis, 86:263-267) . Obviamente, tal sistema necesita más desarrollo para aumentar la producción de la proteína de interés recombinante.

En la primera generación de vectores virales sistémicos, se gastó una gran proporción de recursos de plantas para la producción de la proteína de recubrimiento viral que es necesaria para el movimiento sistémico de un replicón viral. Para los vectores derivados del TMV (Virus del Mosaico del Tabaco) este problema se resolvió eliminando el gen de la proteína de recubrimiento y mediante el uso de agro infiltración para la administración sistémica eficaz de los replicones, reforzando así significativamente la producción de proteínas de interés recombinantes (WO2005/049839; Marillonnet et al., (2005) , Nat. Biotechnol., 23:718-723) . Sin embargo, a diferencia de los replicones derivados del TMV, los replicones derivados de potexvirus requieren la proteína de recubrimiento viral no solamente para el movimiento sistémico, sino también para el de corta distancia (de célula a célula) . Por lo tanto, el gen de la proteína de recubrimiento de los vectores virales derivados de potexvirus no puede eliminarse sin una grave pérdida de la eficacia de la expresión de la proteína. Además, la modificación genética del hospedador de planta que proporcione proteína de recubrimiento viral en trans es raramente una buena solución debido al silenciamiento génico. Además, las plantas transgénicas que expresan la proteína de recubrimiento podrían presentar resistencia mediada por la proteína de recubrimiento a exposiciones por virus de planta (Beachy, RN., 1999, Philos. Trans. R. Soc. Lond B Biol. Sci, 354:659-664; Wisniewski et al., 1990, Plant Cell, 2:559-567) . Otro fenómeno similar, denominado resistencia mediada por la CP heteróloga, puede ser un problema, por ejemplo, cuando una planta transgénica que expresa la CP del PVX reduce la propagación de célula a célula del ARN del TMV (Bazzini et al., 2006, J. Gen. Virol., 87:1005-1012) . Además, la expresión de la proteína de recubrimiento del PVX en plantas de tabaco transgénicas recupera al PVX del movimiento deficiente, pero compromete la eficacia del movimiento de célula a célula y la replicación viral (Spillane et al., 1997, Virology, 236:76-84) . Esto podría ser un problema cuando se requiere el uso de dos vectores virales (por ejemplo, vectores basados en el TMV y en el PVX) , en la misma célula de planta, para la expresión de proteínas hetero-oligoméricas (por ejemplo, para la expresión conjunta de las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo monoclonal) (documento WO2006/079546; Giritch et al., 2006, Proc. Natl. Acad. Sci USA, en prensa) .

Descripción general de la invención

Es por lo tanto un objetivo de la invención proporcionar un vector viral basado en potexvirus para la expresión de alta producción de una proteína de interés en plantas, en tejido de plantas o en células de plantas. El vector viral debería poder moverse de célula a célula y para producir la proteína de recubrimiento viral apenas debería consumir los recursos de un hospedador de planta.

Este objetivo se resuelve mediante un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1.

También se describe un ácido nucleico que comprende o que codifica un replicón de ARN que comprende, en este orden, los siguientes segmentos:

(i) una secuencia de ácido nucleico que codifique una ARN polimerasa dependiente de ARN o un derivado conservador de la función de la misma;

(ii) una secuencia de ácido nucleico que comprenda un bloque genético triple de potexvirus o una variante conservadora de la función del mismo y una proteína de recubrimiento potexviral o una variante conservadora de la función de la misma;

(iii) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que pueda expresarse a partir de dicho replicón en una planta o en un tejido de planta;

o una secuencia complementaria de los mismos.

Adicionalmente se describe un ácido nucleico que comprende o codifica un replicón de ARN que comprende, en este orden, los siguientes segmentos:

(i) una secuencia de ácido nucleico que codifique una ARN polimerasa de ARN dependiente de ARN o un derivado conservador de la función de la misma;

(ii) una secuencia de ácido nucleico que comprenda un bloque genético triple de potexvirus o una variante conservadora de la función del mismo y una proteína de movimiento tobamoviral; y

(iii) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que pueda expresarse a partir de dicho replicón en una planta o en un tejido de planta;

o una secuencia complementaria de los mismos.

Dicho replicón de ARN puede ser un replicón para replicar y expresar dicha secuencia de ácido nucleico heterólogo en una planta o tejido de planta. Dicho replicón de ARN puede construirse en un potexvirus y usa el sistema de replicación y expresión de un potexvirus para expresar una secuencia de ácido nucleico heterólogo.

El ácido nucleico de la invención puede ser un ácido nucleico aislado, o uno aislado y purificado. El ácido nucleico de la invención se usa típicamente como un vector para transfectar o transformar una planta o células de plantas.

La invención también proporciona un kit de partes, que comprende al menos dos vectores (provectores) que, en células de planta, por recombinación dirigida a sitio, pueden ensamblar dicho ácido nucleico de la invención.

La invención también proporciona un procedimiento para la expresión de una secuencia de interés de ácido nucleico heterólogo en una planta o en un tejido de planta, que comprende proporcionar una planta o tejido de planta con dicho ácido nucleico de la invención. La invención también proporciona un procedimiento para la expresión de una secuencia de interés de ácido nucleico heterólogo en una planta o tejido de planta, que comprende proporcionar una planta o tejido de planta con dos o más vectores que sean capaces de ensamblar dicho ácido nucleico de la invención en células de planta por recombinación dirigida al sitio.

De manera sorprendente los autores de la invención han identificado un modo para aumentar la producción de la expresión de una proteína de interés que se expresa en una planta o en un tejido de planta, a partir de un vector potexviral mediante un diseño vectorial en el que las... [Seguir leyendo]

1. Un ácido nucleico que comprende o que codifica un replicón de ARN que comprende, en este orden, los siguientes segmentos (i) a (iii) :

(i) una secuencia de ácido nucleico que codifique una ARN polimerasa dependiente de ARN de potexvirus o una variante conservadora de la función de la misma; en la que dicha secuencia del punto (i) codifica una proteína que tiene una identidad de secuencia de al menos 36% con una proteína codificada por la SEC ID NO:4 dentro de un segmento de secuencia de proteína de al menos 300 restos aminoacídicos;

(ii) una secuencia de ácido nucleico que comprenda:

(a) un bloque genético triple de potexvirus o una variante conservadora de la función del mismo, en el que dicha variante conservadora de la función de dicho bloque genético triple de potexvirus codifica las tres proteínas siguientes: una primera proteína que comprende un segmento de secuencia de proteína de al menos 200 restos aminoacídicos, teniendo dicho segmento de secuencia de proteína una identidad de secuencia al menos 40% con un segmento de secuencia de la SEC ID NO:10; una segunda proteína que comprende un segmento de secuencia de proteína de al menos 100 restos aminoacídicos, teniendo dicho segmento de secuencia de proteína una identidad de secuencia de al menos 40% con un segmento de secuencia de la SEC ID NO:12; y una tercera proteína que comprende un segmento de secuencia de proteína de al menos 55 restos aminoacídicos, teniendo dicho segmento de secuencia de proteína una identidad de secuencia de al menos 40% con un segmento de secuencia de la SEC ID NO:14; y

(b) una secuencia que codifique una proteína de recubrimiento potexviral o una variante conservadora de la función de la misma; o una secuencia que codifique una proteína de movimiento tobamoviral; en la que dicha variante conservadora de la función de dicha proteína de recubrimiento tobamoviral comprende un segmento de secuencia de proteína de al menos 200 restos aminoacídicos, teniendo dicho segmento de secuencia una identidad de al menos 35% con un segmento de secuencia de la SEC ID NO: 8; y

(iii) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que puede expresarse a partir de dicho replicón en una planta o en un tejido de planta

o una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia complementaria de dicho ácido nucleico.

2. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha variante conservadora de la función del bloque genético triple de potexvirus codifica tres proteínas, una de las cuales tiene una identidad de secuencia de al menos 33% con la SEC ID NO: 10; una que tiene una identidad de secuencia de al menos 36% con la SEC ID NO: 12; y una que tiene una identidad de secuencia de al menos 30% con la SEC ID NO: 14.

3. El ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en que dicha secuencia del punto (i) codifica una proteína que tiene una identidad de secuencia de al menos 36% con una proteína codificada por la SEC ID NO:4 dentro de un segmento de secuencia de proteína de al menos 500 restos aminoacídicos, preferiblemente de al menos 900 restos aminoacídicos, y lo más preferible, de al menos 1400 restos aminoacídicos.

4. El ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha secuencia del punto (i) codifica una proteína que tiene una identidad de secuencia de al menos 45% con una proteína codificada por la SEC ID NO:4 dentro de un segmento de secuencia de proteína de al menos 300 restos aminoacídicos, preferiblemente de al menos 500 restos aminoacídicos, más preferiblemente de al menos 900 restos aminoacídicos, y lo más preferible, de al menos 1400 restos aminoacídicos.

5. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dicha secuencia del punto (i) codifica una proteína que tiene una homología de secuencia de al menos 50% con una proteína codificada por la SEC ID NO:4 dentro de un segmento de secuencia de proteína de al menos 300 restos aminoacídicos, preferiblemente de al menos 500 restos aminoacídicos, más preferiblemente de al menos 900 restos aminoacídicos, lo más preferible, de al menos 1400 restos aminoacídicos.

6. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicha secuencia de ácido nucleico del punto (i) tiene una identidad de secuencia de al menos 55%, preferiblemente de al menos 60%, con la SEC ID NO: 4 dentro de un segmento de secuencia de al menos 900 nucleótidos, preferiblemente de al menos 1500 nucleótidos, más preferiblemente de al menos 2700 nucleótidos, y lo más preferible, de al menos 4200 nucleótidos.

7. El ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho replicón es un replicón potexviral, preferiblemente un replicón derivado del virus X de la patata, del potexvirus del mosaico del bambú o del potexvirus del

mosaico de la papaya.

8. Un ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho replicón no tiene un origen de ensamblaje de partícula viral; y/o dicho ácido nucleico comprende una secuencia seleccionada del grupo: un promotor de transcripción activo en células de planta cadena arriba del punto (i) , un promotor subgenómico viral, una región 5' ó 3' no traducida potexviral.

9. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los puntos (a) y (b) pueden estar en cualquier orden en dicha secuencia de ácido nucleico del punto (ii) , preferiblemente, en el punto (ii) , dicho bloque genético triple de potexvirus o una variante conservadora de la función del mismo se localiza cadena arriba de dicho gen de proteína de recubrimiento potexviral o de una variante conservadora de la función del mismo, o viceversa.

10. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha proteína de movimiento tobamoviral es una proteína de movimiento del virus del mosaico del tabaco o del virus de aclaramiento de las nervaduras del nabo o una variante conservadora de la función de dichas proteínas de movimiento.

11. Un kit de partes que comprende al menos dos vectores que, en células de planta, por recombinación específica de sitio, pueden ensamblar dicho ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. El kit de partes de acuerdo con la reivindicación 11, que comprende al menos dos vectores, un primer vector que comprende o que codifica los segmentos de los puntos (i) y (ii) de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y un segundo vector que comprende o que codifica el segmento del punto (iii) de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que cada uno de dicho primer y segundo vector tiene un sitio de recombinación para permitir el ensamblaje, por recombinación específica de sitio, de un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

13. Un procedimiento para la expresión de una secuencia de interés de ácido nucleico heterólogo en una planta o en un tejido de planta, que comprende proporcionar una planta o un tejido de planta con dicho ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.