Proceso para producir una o más de una proteína de interés, que comprende:

(a) proporcionar una planta o célula de planta que comprende:

(i) en un cromosoma nuclear una primera secuencia nucleotídica heteróloga que comprende:

una secuencia nucleotídica que codifica para un replicón de ARN, y un primer promotor inducible ligado operativamente a la secuencia nucleotídica que codifica para el replicón de ARN;

el replicón de ARN no codifica para una proteína que proporciona el movimiento célula a célula del replicón de ARN en la planta;

el replicón de ARN codifica para una polimerasa para replicar el replicón de ARN y una o más de una proteína de interés; y

(ii) una segunda secuencia nucleotídica heteróloga que comprende una secuencia que codifica para una proteína que permite el movimiento célula a célula del replicón de ARN, donde la segunda secuencia nucleotídica heteróloga comprende un segundo promotor inducible ligado operativamente a la secuencia que codifica para la proteína que permite el movimiento célula a célula del replicón de ARN; y

(b) inducir, en la planta o célula de la planta del paso (a), el primer y segundo promotor inducible, produciendo por lo tanto una o más de una proteína de interés en la planta o en la célula de planta, respectivamente.

Sistema de expresión inducible basado en virus de plantas

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invención se relaciona con un proceso de producción o expresión de una o más de una proteína de interés en plantas o células de planta usando un sistema de expresión viral. La invención se relaciona además con plantas o células de plantas, especialmente plantas o células de plantas transgénicas, para este proceso. La invención también proporciona un proceso para producir las plantas o células de plantas de la invención.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

La expresión de alto rendimiento de proteínas heterólogas en plantas puede en principio ser lograda usando vectores virales. Sin embargo, a pesar de la existencia de diferentes sistemas de expresión viral de plantas, los sistemas de expresión viral de plantas son predominantemente usados para la expresión transitoria de una proteína de interés en plantas después de una infección (Donson et al., 1991, Proc Natl Acad Sci USA, 88:7204-7208; Chapman, Kavanagh & Baulcombe, 1992, Plant J., 2:549-557) o transfección (Marillonnet et al., 2005, Nat. Biotechnol., 23:718-723; Santi et al., 2006, Proc Natl Acad Sci USA. 103:861-866; WO2005/049839) de una planta anfitriona con un vector viral recombinante. A pesar de las diferentes publicaciones científicas y solicitudes de patente publicadas, no existen aún sistemas de producción basados en virus comerciales establecidos disponibles que pudieran facilitar el escalamiento ascendente y proporcionar un alto rendimiento, predominantemente debido a dos razones principales:

Primera, los sistemas de expresión basados en virus de plantas transitorios se restringen generalmente a anfitriones específicos los cuales pueden no ser adecuados para el cultivo a gran escala debido a su susceptibilidad a factores ambientales. Además, ellos se restringen generalmente a ciertas partes de una planta anfitriona, excluyendo de este modo la mayoría de la biomasa de la planta del proceso de producción y como resultado minimiza el rendimiento relativo de producto recombinante por unidad de biomasa de planta a un nivel bajo comparable con el logrado usando promotores de transcripción convencionales en una planta transgénica;

Segunda, los intentos por escalar de manera ascendente de los sistemas de producción basados en virus generando plantas anfitrionas transgénicas que tienen el replicón viral integrado de manera estable en cada célula no proporcionan una solución, en particular debido al subdesempeño de los replicones en esa posición y debido a que la formación constante de replicones virales comprende el crecimiento y desarrollo de la planta. Usualmente, los vectores virales sistémicos en sistemas de expresión transitorios pueden tolerar insertos relativamente cortos (de hasta un kb) de ácidos nucleicos heterólogos siendo de este modo restringidos a la expresión de proteína relativamente pequeñas. Los vectores virales usados para la transfección (liberación mediada por agrobacterium, WO2005/049839) pueden expresar insertos más grandes, pero requieren agroinfiltración de plantas completas. Obviamente, esos sistemas son convenientes para la producción de muchas proteínas recombinantes incluyendo antígenos, puesto que requieren un tiempo breve para emplearse y escalarse ascendentemente, pero las versiones transgénicas de sistemas de expresión basados en vectores podrían ser una ventaja en muchas otras aplicaciones. Especialmente, éste es un problema para la producción de proteínas recombinantes requeridas en grandes cantidades y a un costo relativamente bajo (por ejemplo diferentes celulasas y otras enzimas técnicas) donde el sistema de expresión transitorio basado en la agro-infiltración (WO2005/049839) podría no ser económicamente viable. La expresión de un vector viral en plantas anfitrionas transgénicas es usualmente dañina para el crecimiento y desarrollo de la planta. También, esa expresión eventualmente conducirá al silenciamiento del transgen. Para encontrar una solución a este problema, se intentó liberar un replicón viral silenciado de cromosomas de planta con la ayuda de supresores del silenciamiento de genes postranscripcionales (PTGS) (US6395962; Mallor y et al., 2002, Nat. Biotechnol., 20:622-625) . Un sistema de expresión inducible por glucocorticoides basado en un ARN virus tripartita de planta (Mori et al., 2001, Plant. J., 27, 79-86) , Virus de Mosaico de Brome (BMV) , dio quizá debido al PTGS, un rendimiento muy bajo de la proteína de interés (3-4 μg/g de peso fresco) , el cual es comparable con los rendimientos proporcionados por promotores transcripcionales estándar (no virales) .

Actualmente no existe un sistema de expresión viral de plantas a gran escala, el rendimiento y eficiencia del cual sea suficientemente alto para competir en el mercado con otros sistemas de expresión a gran escala como sistemas de expresión bacterianos, micóticos o células de insecto. Esa expresión en plantas tendría que satisfacer los siguientes criterios también como sea posible:

(i) alto rendimiento, incluyendo la expresión de la proteína de interés en tantos tejidos de planta como sea posible y en muchas células de los tejidos;

(ii) prevenir un efecto dañino de la expresión de la proteína sobre la sobrevivencia de las células de planta, la expresión de la proteína o producto de interés deberá comenzar en todas las células de planta de la planta tratada o tejido de planta al mismo tiempo.

Típicamente, la proteína o producto de interés se acumula con cada célula produciendo el producto o proteína hasta un cierto punto. Durante la acumulación, sin embargo, los procesos degradantes frecuentemente son los que tienden a reducir el rendimiento o calidad de la proteína o producto de interés. Por lo tanto, existe un punto óptimo en el tiempo, donde el producto o proteína de interés deberá ser cosechado. Este punto óptimo en el tiempo deberá ser alcanzable en todos los tejidos o células de una planta y en todas las plantas de un lote seleccionado al mismo tiempo para hacer el proceso total eficiente y redituable.

DESCRIPCIÓN GENERAL DE LA INVENCION

Por lo tanto, es un objetivo de la invención proporcionar un proceso de expresión de una o más proteínas en un sistema de planta que es fácilmente capaz de aplicaciones a gran escala, da un alto rendimiento de una proteína a ser expresada, y, al mismo tiempo, es biológicamente seguro dado que la probabilidad de expresión descontrolada de la proteína recombinante de interés es baja. Es además un objetivo de la invención proporcionar un método eficiente de producción de plantas transgénicas que codifican para un replicón viral adecuado para una expresión de una proteína de interés del replicón viral.

De este modo, la invención proporciona un proceso para producir una o más de una proteína de interés, que comprende:

(a) proporcionar una planta o células de planta que comprende: una primera secuencia nucleotídica heteróloga que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para un replicón de ARN, y un primer promotor inducible ligado operativamente a la secuencia nucleotídica que codifica para el replicón de ARN; el replicón de ARN no codifica para una proteína que proporciona el movimiento célula a célula del replicón de ARN en la planta; el replicón de ARN que codifica para una polimerasa y una o más de una proteína de interés, estando la polimerasa adaptada para replicar el replicón de ARN; e

(b) inducir, en la planta o células de planta del paso (a) , el promotor inducible, produciendo, por lo tanto una o más de una proteína de interés en la planta o células de planta.

La invención proporciona además un proceso para producir una o más de una proteína de interés que comprende:

(a) proporcionar una planta que comprende

(i) una primera secuencia nucleotídica heteróloga que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para un replicón de ARN, y un primer promotor inducible ligado operativamente a la secuencia nucleotídica que codifica para el replicón de ARN; el replicón de ARN no codifica para una proteína que proporciona el movimiento célula a célula del replicón de ARN en la planta; el replicón de ARN que codifica para una polimerasa y una o más de una proteína de interés, estando la polimerasa adaptada para replicar al replicón de ARN; y

(ii) una segunda secuencia nucleotídica heteróloga que comprende una secuencia que codifica para una proteína que permite el movimiento célula a célula del replicón de ARN, donde la segunda secuencia nucleotídica heteróloga... [Seguir leyendo]

1. Proceso para producir una o más de una proteína de interés, que comprende:

(a) proporcionar una planta o célula de planta que comprende:

(i) en un cromosoma nuclear una primera secuencia nucleotídica heteróloga que comprende: una secuencia nucleotídica que codifica para un replicón de ARN, y un primer promotor inducible ligado operativamente a la secuencia nucleotídica que codifica para el replicón de ARN; el replicón de ARN no codifica para una proteína que proporciona el movimiento célula a célula del replicón de ARN en la planta; el replicón de ARN codifica para una polimerasa para replicar el replicón de ARN y una o más de una proteína de interés; y

(ii) una segunda secuencia nucleotídica heteróloga que comprende una secuencia que codifica para una proteína que permite el movimiento célula a célula del replicón de ARN, donde la segunda secuencia nucleotídica heteróloga comprende un segundo promotor inducible ligado operativamente a la secuencia que codifica para la proteína que permite el movimiento célula a célula del replicón de ARN; y

(b) inducir, en la planta o célula de la planta del paso (a) , el primer y segundo promotor inducible, produciendo por lo tanto una o más de una proteína de interés en la planta o en la célula de planta, respectivamente.

2. Proceso según la reivindicación 1, donde el primero y segundo promotor inducibles son inducibles por la misma señal inductora.

3. Proceso según la reivindicación 1 o 2, donde el primero o el segundo promotor inducible es un promotor inducible químicamente.

4. Proceso según la reivindicación 3, donde el promotor inducible químicamente es seleccionado del grupo que consiste de un promotor inducible por etanol, un promotor inducible por IPTG, y un promotor inducible por tetraciclina.

5. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el promotor inducible es un promotor inducible por choque térmico.

6. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el replicón de ARN es derivado de un ARN virus de una sola hebra de sentido positivo.

7. Proceso según la reivindicación 6, donde el ARN virus de una sola hebra de sentido positivo es el virus del mosaico del tabaco o el virus X de la patata.

8. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la planta comprende una tercera secuencia nucleotídica heteróloga que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para un replicón de ARN adicional y un tercer promotor inducible ligado operativamente a la secuencia que codifica para el replicón de ARN adicional, no codificando el replicón de ARN adicional para una proteína que proporciona el movimiento célula a célula del replicón de ARN ni del replicón de ARN adicional en la planta, codificando el replicón de ARN adicional para un proteína de interés.

9. Proceso según la reivindicación 8, donde la planta comprende una secuencia nucleotídica heteróloga que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para una proteína que permite el movimiento célula a célula del replicón de ARN adicional ligado operativamente a una secuencia nucleotídica que codifica para la proteína que permite el movimiento célula a célula del replicón de ARN.

10. Proceso según la reivindicación 9, donde la proteína que permite el movimiento célula a célula del replicón de ARN y la proteína que permite el movimiento célula a célula del replicón de ARN adicional son las mismas proteínas

o son proteínas diferentes.

11. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, donde el tercer promotor inducible es inducible por el mismo agente inductor que el primer promotor inducible.

12. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, donde el replicón de ARN y el replicón de ARN adicional no son replicones competitivos.

13. Proceso según la reivindicación 12, donde los replicones no competitivos son replicones virales de planta derivados de virus de planta de diferentes géneros de virus.

14. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde el paso (a) comprende hacer crecer una planta de una semilla que comprende la primera secuencia nucleotídica heteróloga y opcionalmente la

segunda y/o la tercera secuencia nucleotídica heteróloga.

15. Planta o célula de planta que comprende:

(i) en un cromosoma nuclear una primera secuencia nucleotídica heteróloga que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para un replicón de ARN, y un primer promotor inducible ligado operativamente a la secuencia nucleotídica que codifica para el replicón de ARN; el replicón de ARN no codifica para una proteína que proporciona el movimiento célula a célula del replicón de ARN en la planta; el replicón de ARN codifica para una polimerasa para replicar el replicón de ARN; y (ii) una segunda secuencia nucleotídica heteróloga que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para una proteína que permite el movimiento célula a célula del replicón de ARN, en donde la segunda secuencia nucleotídica heteróloga comprende un segundo promotor inducible ligado operativamente a la secuencia nucleotídica que codifica para la proteína que permite el movimiento célula a célula del replicón de ARN.