Una planta, parte de planta o cultivo de células de planta, transformada de manera estable,

que contiene en el núcleo de la célula un ADN heterólogo que tiene una secuencia que codifica un replicón de ARN unido operativamente a un promotor de la transcripción,

en el que la secuencia que codifica un replicón de ARN contiene:

(i) secuencias para la función de replicón del replicón de ARN, codificando dichas secuencias una ARN polimerasa dependiente de ARN y derivándose de una secuencia de virus de ARN de planta, y

(ii) una secuencia de interés para expresarse a partir de ese replicón de ARN,

comprendiendo dichas secuencias, para la función de replicón, cerca o dentro de ubicaciones ricas en A/U de dichas secuencias para la función del replicón, la inserción de uno o más intrones nucleares, siendo las ubicaciones ricas en A/U segmentos de secuencia de al menos 20 nucleótidos de longitud con al menos el 55% de contenido en A/U o segmentos de secuencia de 6-19 nucleótidos en una hilera de secuencias que únicamente contienen A/U

Sistema de expresión de planta derivado de virus de ARN.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a plantas, partes de plantas o cultivos de células de plantas que tienen un ADN heterólogo que codifica un replicón de ARN para expresar una secuencia de interés. La invención también proporciona un proceso para expresar una secuencia de interés en plantas, partes de plantas o cultivos de células de plantas. El proceso y los vectores proporcionan las células de planta con una frecuencia aumentada de formación de ARN de replicón de ARN derivado de virus. Este ADN heterólogo o parte (partes) del mismo puede incorporarse de manera estable en el ADN cromosomal o episomal nuclear de la planta o suministrarse de manera transitoria. La invención también proporciona procesos de transformación de plantas mediados por Agrobacterium con vectores virales (ARN) o replicones virales (ARN).

Antecedentes de la invención

Entre los sistemas de expresión de transgénicos de planta, la expresión de un transgénico bajo el control de un promotor heterólogo ha estado en uso durante varios años. Aparte de esos sistemas de expresión de planta convencionales, pueden usarse los sistemas de expresión basados en virus para la producción rápida de proteína en plantas (para repaso, ver: Porta & Lomonossoff, 1996, Mol. Biotechnol., 5, 209-221; Yusibov et al., 1999, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 240, 81-94) y son una herramienta poderosa para los estudios de genómicos funcionales (Dalmay et al., 2000, Plant Cell, 12, 369-379; Ratcliff et al., 2001, Plant J., 25, 237-245; Escobar et al., 2003, Plant Cell, 15, 1507-1523). Numerosas publicaciones y Patentes en el campo describen sistemas basados en vectores virales de ADN y ARN (Kumagai et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 427-430; Mallory et al., 2002, Nature Biotechnol. 20, 622-625; Mor et al., 2003, Biotechnol. Bioeng., 81, 430-437; US5316931; US5589367; US5966785; US5491076; US5977438; US981236; WO02088369; WO02097080; WO9854342). Los sistemas existentes de vector viral están usualmente restringidos a un estrecho rango de huésped en términos de su mejor desempeño y aún del nivel de expresión de esos vectores en su huésped más favorable está muy por debajo de los límites biológicos superiores del sistema. Una cuestión importante de los sistemas basados en virus es el método de suministro del replicón viral a una célula de planta. El método más ampliamente aplicado de suministro para la producción a gran escala (producción simultánea en diversas plantas, por ejemplo, en un terreno de granja o un invernadero) es el uso de copias infecciosas de vectores virales de ARN (Kumagai et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 1679-1683). Debido a una tendencia relativamente alta de los vectores recombinantes de ARN viral para perder los insertos heterólogos durante los ciclos de su replicación, el método requiere la transcripción in vitro de moldes de ADN, y como resultado es ineficaz y costoso. Otro enfoque para resolver el problema del suministro podría ser la presencia de un precursor de replicón de ARN viral en cada célula de una planta transgénica, de modo que pudiera liberarse al activar el proceso de replicación complementando una función del vector viral (por ejemplo usando un virus auxiliar - Patente US5965794) o usando otros sistemas de intercambio regulados (por ejemplo la recombinación específica en sitio - Patente US6632980).

A pesar de las muchas publicaciones en el campo que incluyen tecnologías patentadas, aún no hay sistemas de producción a gran escala basados en virus que funcionen con eficacia suficiente y rindan para la producción comercial de alto rendimiento, predominantemente debido a dos razones principales:

En primer lugar, los sistemas de expresión de plantas transitorias basados en virus generalmente se restringen a huéspedes específicos, que pueden no ser adecuados para el cultivo a gran escala debido a su susceptibilidad a los factores ambientales. Además, generalmente están restringidos a ciertas partes de un huésped de planta, excluyendo por lo tanto la mayoría de la biomasa de la planta del proceso de producción, y como resultado se minimiza la producción relativa del producto recombinante por unidad de biomasa de planta por debajo de un nivel comparable al que se logra con un promotor de transcripción convencional en una planta transgénica;

En segundo lugar, los intentos para el cambio de escala del sistema de producción basado en virus a través de generar huéspedes de planta transgénicos que tengan el precursor de replicón viral establemente integrado en cada célula tampoco han proporcionado una solución, en particular debido al bajo desempeño de los replicones en esa posición, a la "escapatoria" del gen de interés para expresarse de ese replicón y a la falta de un sistema de intercambio eficaz para esos vectores. Se logró cierto progreso con los vectores basados en PVX usando supresores del silenciamiento de PTGS como activadores de la formación del replicón de ARN (Mallory et al., 2002, Nature Biotechnol., 20, 622-625), pero el sistema es todavía impráctico, ya que no se proporciona una solución para un control eficaz del intercambio (supresor de PTGS) que activa la replicación del vector viral. Sin embargo, este sistema proporcionó un nivel de expresión del gen GUS que alcanzó el 3% de la proteína soluble total (TSP, siglas en inglés), que es el mejor que se conoce hasta ahora para este tipo de sistema, pero que aún no es mejor que un sistema convencional de expresión transgénica bajo el control de un promotor fuerte. Otro sistema de inducción basado en un virus de planta de ARN tripartita (Mori et al., 2001, Plant J., 27, 79-86), el Virus del Mosaico del Bromo (BMV, siglas en inglés), dio una producción muy baja de la proteína de interés (3-4 µg/g de peso fresco), que es comparable con las producciones proporcionadas por los promotores transcripcionales convencionales.

Los bajos niveles de expresión hasta ahora logrados con los sistemas de expresión de planta son una razón principal del por qué estos sistemas son duramente competitivos con otros sistemas de expresión como los sistemas de expresión de células bacterianas, fúngicas o de insecto. Los niveles de expresión bajos dan lugar a costes muy altos aguas abajo para el aislamiento de la proteína y la purificación en un entorno amplio del material de planta. Por lo tanto, los costes para el procesamiento aguas abajo disminuyen rápidamente, a medida que se incrementa la producción de la proteína o del producto de interés por unidad de biomasa de planta.

Actualmente no hay un sistema de expresión transgénica de planta a gran escala cuya producción y cuya eficacia pudieran ser suficientemente altas como para competir en el mercado con otros sistemas de expresión a gran escala tales como los sistemas de expresión de células bacterianas, fúngicas o de insecto. Una expresión de planta así debería cumplir lo mejor posible con los siguientes criterios:

(i) alta producción, incluyendo la expresión de la proteína de interés en tantos tejidos de planta como fuera posible y en muchas células de esos tejidos.

(ii) para prevenir un efecto nocivo de la expresión de la proteína en el crecimiento de la planta, la expresión de la proteína o del producto de interés debería ser intercambiable de modo que la expresión pueda ser intercambiada en un punto deseado en el tiempo.

(iii) el intercambio debería ser tal que la expresión pueda intercambiarse simultáneamente o casi simultáneamente en todos los tejidos o células de una planta y, al mismo tiempo, en todas las plantas de un grupo de plantas seleccionado, por ejemplo, en todas las plantas de un lote de plantas seleccionado. Típicamente, la proteína o el producto de interés se acumula en cada célula que produce ese producto o proteína hasta un cierto punto. Sin embargo, durante la acumulación se establecen con frecuencia procesos degradantes que tienden a reducir la producción o la calidad de la proteína o del producto de interés. Por lo tanto, hay un punto óptimo en el tiempo después del intercambio de la expresión, en el que el producto o la proteína de interés debería recogerse. Este punto óptimo en el tiempo debería alcanzarse al mismo tiempo en todos los tejidos o células de una planta y en todas las plantas de un lote seleccionado, para hacer el proceso general eficiente y provechoso.

Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar...

1. Una planta, parte de planta o cultivo de células de planta, transformada de manera estable, que contiene en el núcleo de la célula un ADN heterólogo que tiene una secuencia que codifica un replicón de ARN unido operativamente a un promotor de la transcripción,

en el que la secuencia que codifica un replicón de ARN contiene:

(i) secuencias para la función de replicón del replicón de ARN, codificando dichas secuencias una ARN polimerasa dependiente de ARN y derivándose de una secuencia de virus de ARN de planta, y

(ii) una secuencia de interés para expresarse a partir de ese replicón de ARN,

comprendiendo dichas secuencias, para la función de replicón, cerca o dentro de ubicaciones ricas en A/U de dichas secuencias para la función del replicón, la inserción de uno o más intrones nucleares, siendo las ubicaciones ricas en A/U segmentos de secuencia de al menos 20 nucleótidos de longitud con al menos el 55% de contenido en A/U o segmentos de secuencia de 6-19 nucleótidos en una hilera de secuencias que únicamente contienen A/U.

2. Una planta, parte de planta o cultivo de células de planta de acuerdo con la reivindicación 1, en la que todos los núcleos de las células de la planta contienen dicho ADN heterólogo.

3. Una planta, parte de planta o cultivo de células de planta de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en la que dicho ADN heterólogo está incluido en un cromosoma de dichos núcleos de las células.

4. Una planta, parte de planta o cultivo de células de planta de acuerdo con la reivindicación 3, en la que todas las células de dicha planta, parte de planta o cultivo de células de planta contienen dicho AN heterólogo en un cromosoma nuclear.

5. Una planta, parte de planta o cultivo de células de planta de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho virus de ARN de planta es un tobamovirus, preferiblemente un virus del mosaico del tabaco.

6. La parte de la planta de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha parte de la planta es una semilla.

7. Un proceso para expresar una secuencia de interés en una planta, parte de planta o cultivo de célula de planta, que comprende,

(a) proporcionar una planta, parte de planta o un cultivo de célula de planta que contiene en los núcleos de las células, un ADN heterólogo que tiene una secuencia que codifica un replicón unido operativamente a un promotor de la transcripción,

en el que dicha secuencia codifica un replicón de ARN que contiene

comprendiendo dichas secuencias de interés para la función de replicón, cerca o dentro de las ubicaciones ricas en A/U de dichas secuencias para la función del replicón, la inserción de uno o más intrones nucleares, siendo las ubicaciones ricas en A/U segmentos de secuencia que tienen una longitud de al menos 20 nucleótidos con un contenido en A/U de al menos el 55% o segmentos de secuencia de 6 a 19 nucleótidos en una hilera de secuencias que únicamente contienen A/U; y

(b) causar la expresión de dicha secuencia de interés.

8. El proceso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho ADN heterólogo se incorpora de manera estable en un cromosoma nuclear.

9. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, en el que dicha secuencia de interés codifica una proteína de interés y la etapa (b) comprende causar la expresión de dicha proteína de interés.

10. El proceso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicha expresión de dicha proteína de interés conduce a la producción de un producto deseado en dicha planta, parte de planta o células de planta.

11. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que dicha secuencia que codifica un replicón de ARN tiene dos o más segmentos que codifican juntos dicho replicón de ARN y la etapa (b) comprende la transposición de dichos segmentos de manera que dicho replicón de ADN pueda formarse, en el que uno de dichos segmentos está flanqueado por sitios de recombinación y dicha transposición comprende una recombinación específica de sitio por una recombinasa.

12. El proceso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que la etapa (b) comprende proporcionar una recombinasa específica de sitio a dicha planta, parte de planta o cultivo de células de planta.

13. El proceso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la recombinasa específica de sitio se proporciona por transfección transitoria con un vector que codifica dicha recombinasa.

14. El proceso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la recombinasa específica de sitio se codifica de manera estable en un cromosoma nuclear bajo el control de un promotor regulado y la etapa (b) comprende inducir dicho promotor regulado.

15. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en el que dicha recombinasa se selecciona del grupo constituido por: CRE, flipasa, resolvasa, FLP, integrasa codificada por SSV1, R recombinasa, integrasa phiC31, integrasa Inti, recombinasa phi 80, P22, 186 y P4, resolvasa Tn3, la recombinasa Hin, la recombinasa Cin, recombinasas xerC y xerD de E. coli, recombinasa de Bacillus thuringiensis.

16. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, en el que dicha recombinasa se forma dentro de células de planta a partir de fragmentos no funcionales de dicha recombinasa por interacción de afinidad.

17. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, en el que dicha recombinasa se forma dentro de las células de la planta a partir de fragmentos no funcionales de dicha recombinasa, por trans-corte y empalme de la proteína mediada por inteína.

18. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 17, en el que dicho ADN heterólogo o dicha secuencia que codifica al replicón de ARN, está unido a un promotor de la transcripción regulado.

19. El proceso de acuerdo con la reivindicación 18, en el que dicho promotor regulado es un promotor químicamente inducible.

20. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 19, en el que dicha provisión de la etapa (a) comprende la transformación de una planta, parte de planta o células de planta con una molécula de ácido nucleico que contenga el ADN heterólogo.

21. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 20, en el que dicha provisión de la etapa (a) comprende la transformación transitoria de una planta, parte de planta o células de planta con una molécula de ácido nucleico que contenga el ADN heterólogo.

22. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 21, en el que la etapa (a) se realiza por transformación mediada con Agrobacterium.

23. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 22, en el que la etapa (a) comprende generar una planta transgénica transformada de manera estable con el ADN heterólogo.

24. Un proceso de producción de una planta transgénica transformada de manera estable en un cromosoma nuclear con un ADN heterólogo como se define en la reivindicación 1, que comprende transformar una planta o una parte de planta con un vector que contenga el ADN heterólogo, seleccionar el tejido de la planta que contenga en un cromosoma nuclear el ADN heterólogo, y regenerar una planta transgénica a partir de ese tejido.

25. Un proceso para expresar transitoriamente una secuencia de interés en una planta, parte de planta o cultivo de células de planta, que comprende:

transformar una planta, parte de planta o cultivo de células de planta con un ADN heterólogo que tenga una secuencia que codifique un replicón de ARN unido operativamente a un promotor de la transcripción,

en el que la secuencia que codifica un replicón de ARN contiene:

(i) secuencias para la función de replicón de dicho replicón de ARN, codificando dichas secuencias una ARN polimerasa dependiente de ARN y derivándose de una secuencia de un virus de ARN de planta,

(ii) una secuencia de interés;

en el que dichas secuencias para la función de replicón comprenden, cerca o dentro de ubicaciones de dichas secuencias ricas en A/U para la función de replicón la inserción de uno o más intrones nucleares, en el que dichas ubicaciones rucas en A/U son segmentos de secuencia de al menos 20 nucleótidos de longitud con al menos el 55% de contenido en A/U o segmentos de secuencia de 6 a 19 nucleótidos en una hilera de secuencias que contienen únicamente A/U.

26. El proceso de acuerdo con la reivindicación 25, en el que la transformación se realiza por transformación transitoria mediada por Agrobacterium del T-ADN que contiene dicho ADN heterólogo.

27. El proceso de acuerdo con la reivindicación 25 ó 26, en el que la transformación se realiza agroinfiltrando el tallo y/o todas las hojas de plantas de Nicotiana tabacum.

28. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 27, en el que todos los núcleos de las células contienen dicho ADN heterólogo.

29. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 28, en el que dicha ubicación se localiza por

(A) transformar una planta, parte de planta o cultivo de células de planta con un ADN heterólogo como se define en la reivindicación 7, pero que carece de dicha inserción en uno o más intrones

(B) realizar RT-PCR en el ARN derivado de dicha planta, parte de planta o cultivo de células de planta a partir de dicho ADN heterólogo de la etapa (A) y secuenciar el producto de dicha RT-PCR, y

(C) identificar en la secuencia del producto de la RT-PCR, una ubicación seleccionada como un evento de corte y empalme no deseado que conduce a productos de corte y empalme no deseados.

30. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 29, en el que dicho virus de ARN de planta es un tobamovirus, preferiblemente un virus del mosaico del tabaco.

31. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 29, en el que dicha planta, parte de planta o cultivo de células de planta contiene dos o más ADN heterólogos diferentes y dicho proceso comprende la formación de dos replicones diferentes de ARN a partir de los cuales se co-expresan dos proteínas de interés diferentes.

32. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 31, en el que dicha planta, parte de planta o cultivo de células de planta se proporciona con dos ADN diferentes heterólogos como se define en la reivindicación 7, en el que se expresan dos secuencias de interés diferentes.

33. Una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia de ADN que codifica un replicón de ARN unido operativamente a un promotor de la transcripción,

en el que dicha secuencia que codifica un replicón d ARN contiene:

(i) secuencias para la función de replicón del replicón de ARN, codificando dichas secuencias una ARN polimerasa dependiente de ARN y derivándose de una secuencia de un virus de ARN de planta

(ii) una secuencia de interés para expresarse a partir del dicho replicón de ARN; en el que dichas secuencias para la función de replicón corresponden a secuencias de dicho virus de ARN de planta y comprenden, cerca o dentro de las ubicaciones ricas en A/U de dichas secuencias de dicho virus de ARN de planta, la inserción de uno o más intrones nucleares, siendo las localizaciones ricas en A/U segmentos de secuencia que tienen una longitud de al menos 20 nucleótidos con al menos el 55% de contenido en A/U o segmentos de secuencia de 6 a 19 nucleótidos en una hilera de secuencias que únicamente contienen A/U;

en el que la secuencia de ADN que codifica un replicón de ARN está unida operativamente al promotor de la transcripción por

(a) una separación de dicha secuencia de ADN que codifica un replicón de ARN y del promotor, por un bloque de secuencia que impide el enlace operativo entre el promotor y dicha secuencia de ADN, estando dicho bloque de secuencia flanqueado por sitios de recombinación, pudiendo cortar dicho bloque una recombinasa que reconoce dichos sitios de recombinación; o

(b) tener una parte de una secuencia necesaria para la transcripción, seleccionada de un promotor y de una parte del promotor, en orientación invertida y flanqueada por sitios de recombinación, pudiendo una recombinasa invertir de nuevo dicha parte de una secuencia a la posición correcta.