Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que codifica una proteína fluorescente,

donde dicha proteína tiene al menos el 90% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 16 en una ventana de comparación de al menos 200 aminoácidos

Nuevas proteínas fluorescentes y métodos para usarlas.

Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere en general al campo de la biología y de la química. Más particularmente, la invención se refiere a proteínas fluorescentes.

Las proteínas fluorescentes incluyendo la Proteína Verde Fluorescente (GFP), sus mutantes y homólogos se conocen ampliamente hoy debido a su intensivo uso como marcadores fluorescentes in vivo en ciencias biomédicas como describen en detalle Lippincott-Schwartz y Patterson en el documento Science (2003) 300(5616): 87-91.

Las proteínas fluorescentes son proteínas que muestran fluorescencia después de irradiarlas con luz de la apropiada longitud de onda de excitación. La característica fluorescente de estas proteínas es una que surge de la interacción de dos o más restos de aminoácidos de la proteína, y no de un único resto de aminoácido.

La GFP de la hidromedusa Aequorea aequorea (sinónimo A. victoria), descrita por Johnson et al., en el documento J Cell Comp Physiol. (1962), 60: 85-104, se descubrió como parte del sistema bioluminiscente de la medusa donde la GFP desempeñaba el papel de un emisor secundario que transforma la luz azul de la fotoproteína aequorina en luz verde. El ADNc que codifica la GFP de A. victoria fue clonado por Prasher et al. (Gene (1992), 111 (2): 229-33). La conclusión fue que este gen puede expresarse de forma heteróloga en prácticamente cualquier organismo debido a la actividad única de la GFP para formar un fluoróforo por sí misma (Chalfie et al., Science 263 (1994), 802-805). Este descubrimiento abre amplias perspectivas para el uso de GFP en biología celular como marca fluorescente codificada genéticamente.

La GFP se aplicó para una amplia gama de aplicaciones incluyendo el estudio de la expresión génica y la localización de proteínas (Chalfie et al., Science 263 (1994), 802-805, y Heim et al. en Proc. Nat. Acad. Sci. (1994), 91: 12501-12504), como herramienta para visualizar orgánulos subcelulares en células (Rizzuto et al., Curr. Biology (1995), 5: 635-642), para la visualización del transporte de proteínas a lo largo de la ruta secretora (Kaether and Gerdes, FEBS Letters (1995), 369: 267-271).

Se está realizando gran cantidad de investigación para mejorar las propiedades de la GFP y para producir reactivos de GFP útiles y optimizados para diversos fines de investigación. Se han desarrollado nuevas versiones de la GFP, tales como un ADN de GFP "humanizado", cuyo producto proteico presenta una mayor síntesis en células de mamífero (Haas, et al., Current Biology (1996), 6: 315-324; Yang, et al., Nucleic Acids Research (1996), 24: 4592-4593). Una de dichas proteínas humanizadas es la "proteína verde fluorescente mejorada" (EGFP) variante mutante de la GFP que tiene dos sustituciones de aminoácidos: F64L y S65T (Heim et al., Nature 373 (1995), 663-664). Otras mutaciones de la GFP dieron como resultado versiones que emiten luz azul, cian y amarilla-verde.

A pesar de la gran utilidad de la GFP, sin embargo, otras proteínas fluorescentes con propiedades similares a o diferentes de la GFP serían útiles en la técnica. En particular, los beneficios de las nuevas proteínas fluorescentes incluyen posibilidades basadas en nuevos espectros y mejor idoneidad para una excitación más amplia. En 1999, se clonaron homólogos de la GFP a partir de especies no bioluminiscentes de Antozoos (Matz et al., Nature Biotechnol. (1999), 17: 969-973). Este descubrimiento demostró que estas proteínas no son un componente necesario de la maquinaria de la bioluminiscencia. Las proteínas similares a GFP obtenidas de antozoos mostraban una gran diversidad espectral incluyendo proteínas fluorescentes cian, verdes, amarillas, rojas y cromoproteínas (CP) no fluorescentes púrpura-azul (Matz et al., Bioessays (2002), 24(10): 953-959). Seguidamente, el ADNc de proteínas similares a GFP se clonó de varias medusas hidroides y Copépodos (Shagin et al., Mol Biol Evol. (2004), 21(5): 841-850). Las proteínas similares a GFP ya mostraban más de 120 homólogos de GFP fluorescentes y coloreados. La similitud de estas proteínas con la GFP varía entre el 80-90% y menos del 25% de identidad en la secuencia de aminoácidos.

Las estructuras cristalinas de la GFP de tipo silvestre y la GFP mutante S65T se han resuelto y muestran que la estructura terciaria de la GFP se parece a un barril (Ormo et al., 1996, Science 273: 1392-1395; Yang, et al., 1996, Nature Biotech 14: 1246-1251). El barril está constituido por láminas beta en una estructura anti-paralela compacta, dentro de la cual está contenida una hélice alfa que contiene el cromóforo. Se confirmó que el cromóforo está formado por ciclación oxidativa de tres restos de aminoácidos consecutivos, como se había inferido a partir de estudios bioquímicos anteriores (Cody et al., Biochemistry (1993) 32, 1212-1218). Todas las proteínas similares a GFP ensayadas compartían el mismo plegamiento en barril beta que la GFP (Ormo et al. Science (1996) 273: 1392-1395; Wall et al. Nat Struct Biol (2000), 7: 1133-1138; Yarbrough et al. Proc Natl Acad Sci USA (2001) 98: 462-467; Prescott et al. Structure (Camb) (2003), 11: 275-284; Petersen et al. J Biol Chem (2003), 278: 44626-44631; Wilmann et al. J Biol Chem (2005), 280: 2401-2404; Remington et al. Biochemistry (2005), 44, 202-212; Quillin et al. Biochemistry (2005), 44: 5774-5787).

La utilidad de las proteínas fluorescentes como herramienta en biología molecular impulsó la búsqueda de otras proteínas fluorescentes con propiedades diferentes y mejoradas, en comparación con las proteínas fluorescentes conocidas. Por lo tanto, es un objeto proporcionar nuevas proteínas fluorescentes que muestren propiedades que no estén disponibles actualmente en las proteínas fluorescentes conocidas, así como ADN que las codifica.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican una nueva proteína fluorescente de Entacmaea quadricolor (EqFP578) y mutantes funcionales de la misma, es decir proteínas relacionadas con EqFP578. En ciertas realizaciones, un ácido nucleico de la presente invención se aísla a partir de Entacmaea quadricolor. En otras realizaciones, un ácido nucleico de la presente invención está manipulado genéticamente.

En ciertas realizaciones, los ácidos nucleicos aislados de la presente invención codifican proteína fluorescente de Entacmaea quadricolor de tipo silvestre de SEC ID Nº 02 (EqFP578). Una secuencia de ácido nucleico ejemplar se muestra en la SEC ID Nº 01.

En otras realizaciones, se proporciona una molécula de ácido nucleico aislado, que tiene una secuencia que hibrida específicamente con partes preseleccionadas de o con toda la cadena complementaria de la SEC ID Nº 01.

En ciertas realizaciones, los ácidos nucleicos de la presente invención codifican una proteína fluorescente que comprende una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente igual que o idéntica a la secuencia de la proteína EqFP578 (SEC ID Nº 02). Por consiguiente, también se contempla que las secuencias de ácido nucleico aisladas que codifican variantes alélicas naturales de la SEC ID Nº 01 estén dentro del alcance de la presente invención.

En ciertas realizaciones, los ácidos nucleicos proporcionados codifican mutantes funcionales de EqFP578 que tienen propiedades bioquímicas y/o espectrales sustancialmente similares o alteradas en comparación con la EqFP578 de tipo silvestre.

En ciertas realizaciones, los ácidos nucleicos aislados de la presente invención codifican una proteína fluorescente mutante que comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual que la secuencia de EqFP578 (SEC ID Nº 02) y que difiere de EqFP578 (SEC ID Nº 02) en al menos una sustitución de aminoácidos.

En realizaciones preferidas, dicha sustitución de aminoácidos se selecciona entre el grupo constituido por R32G y S131P; dicha proteína fluorescente mutante tiene un plegamiento mejorado a 37ºC que EqFP578. En realizaciones preferidas, dicho mutante comprende ambas sustituciones.

En realizaciones preferidas, dicho mutante comprende además otras...

1. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que codifica una proteína fluorescente, donde dicha proteína tiene al menos el 90% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 16 en una ventana de comparación de al menos 200 aminoácidos.

2. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha proteína tiene al menos el 90% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 en una ventana de comparación de al menos 200 aminoácidos y en la que la proteína fluorescente comprende al menos una sustitución de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por R32G y S131P, y en la que la proteína fluorescente opcionalmente comprende además una sustitución seleccionada entre el grupo constituido por E36G, K42R, F53V, K67R, T68A, L79F, 193V, F110L, N112D, 1115L, R138L, G152S, H157R, Y169H, H1711, C172A, F174L, K188R, H193Y, M216V, K220R y R231K.

3. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha proteína tiene al menos el 90% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 en una ventana de comparación de al menos 200 aminoácidos y en la que la proteína fluorescente comprende una secuencia de aminoácidos N-terminal adicional seleccionada entre el grupo constituido por MGEY y MGED.

4. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha proteína tiene al menos el 90% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 en una ventana de comparación de al menos 200 aminoácidos y en la que la proteína fluorescente comprende al menos una sustitución de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por R155E, Q159D, F192V, S173N, F194Y y N122R y tiene una capacidad de oligomerización reducida en comparación con EqFP578.

5. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha proteína tiene al menos el 90% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 en una ventana de comparación de al menos 200 aminoácidos y en la que la proteína fluorescente comprende al menos una sustitución de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por H197R, S158G, N143S, N143H, N143F y N143Y, en la que dicha proteína fluorescente tiene un espectro de excitación y uno de emisión diferentes de los espectros de EqFP578.

6. Un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la proteína fluorescente comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 16.

7. Un vector que comprende el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1.

8. Una casete de expresión que comprende (a) una región de inicio de la transcripción funcional en un huésped de expresión; (b) el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1; y (c) una región de terminación de la transcripción funcional en dicho huésped de expresión.

9. Un huésped o progenie del mismo, que comprende la casete de expresión de acuerdo con la reivindicación 8 como parte de un elemento extracromosómico, o integrada en el genoma de una célula huésped como resultado de la introducción de dicha casete de expresión en dicha célula huésped.

10. Un proceso para la fabricación de una célula transgénica que comprende introducir el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 en una célula.

11. Una proteína fluorescente aislada que es codificada por el ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 1-6.

12. Una proteína fluorescente aislada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos el 90% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 16.

13. Una proteína fluorescente de acuerdo con la reivindicación 12, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 16.

14. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la proteína fluorescente comprende al menos una sustitución de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por K6T y R231S.