METODO PARA LA IDENTIFICACION DE POLIPEPTIDOS ANTIBACTERIANOS Y ANTIVIRALES OBTENIDOS DE MYTILUS EDULIS.

La invención proporciona un método para la identificación de polinucleótidos que codifican las formas precursoras de polipéptidos de las familias de las miticinas y de las mitilinas.

La invención proporciona igualmente las miticinas y mitilinas identificadas con dicho método, así como su uso como agentes antibacterianos y antivirales

Método para la identificación de polipéptidos antibacterianos y antivirales obtenidos de Mytilus edulis.

Campo técnico de la invención

La invención se relaciona con un método para la identificación de polinucleótidos que codifican las formas precursoras de polipéptidos de las familias de las miticinas y de las mitilinas, así como a las miticinas y mitilinas identificadas con dicho método y a su uso como agentes antibacterianos y antivirales.

Antecedentes

El cultivo de moluscos bivalvos supone una de las mayores producciones de la acuicultura en la Unión Europea llegando a constituir más del 70% de la producción mundial. Concretamente, el cultivo del mejillón (Mytilus galloprovincialis y Mytilus edulis, fundamentalmente) supera las 500.000 toneladas de producción cada año (593.000 toneladas en 2003 según datos de la FAO). A pesar de la elevada producción de estos moluscos, y de la existencia de enfermedades que afectan gravemente a su producción, con las importantes pérdidas económicas que ello conlleva, poco se conoce de cómo responden estos organismos a la enfermedad. Los bivalvos, al igual que el resto de los invertebrados, carecen de un sistema inmune adaptativo específico y sólo poseen un sistema inmune innato que actúa independientemente de la naturaleza del estímulo, lo que imposibilita el uso de vacunas al carecer de memoria inmunológica. Con estas limitaciones, el control de las enfermedades se basaba fundamentalmente en el diagnóstico del agente patógeno y en el buen manejo de los stocks.

Recientemente se han descrito en mejillón una serie de pequeños péptidos con actividad antimicrobiana, capaces de reducir el crecimiento de varios microorganismos analizados. La patente estadounidense US6911524 y Mitta,G. et al. (Eur. J. Biochem., 265:71-78) describen dos péptidos aislados de la hemolinfa de Mytilus galloprovincialis, denominados miticina A y B, que muestran actividad bactericida, fungicida y antiparasitaria frente a ciertos patógenos. Charlet, M. et al. (J Biol. Chem., 1996, 271:21808-21813) han descrito dos polipéptidos aislados de la hemolinfa de Mytilus edulis denominados mitilinas A y B que muestran actividad bactericida. Mitta, G. et al (J. Biol. Chem., 2000, 275:12954-12962) han descrito tres nuevas isoformas de las mitilinas denominadas mitilinas C, D y G1 que también muestran actividad bactericida y fungicida.

Sin embargo, la puesta en práctica de dichos péptidos como agentes para el control de patógenos requiere de disponer de cantidades suficientes de ellos. Esto sólo es posible mediante la expresión de los péptidos de forma recombinante en células heterólogas, ya que la purificación usando métodos convencionales a partir de los extractos de hemolinfa sólo produce cantidades muy limitadas de los mismos. Con el fin de poner a punto sistemas para la expresión recombinante de estos péptidos, es necesario disponer de la correspondiente secuencia de ADNc. La forma habitual para obtener la secuencia de ADNc para este tipo de péptidos consiste en realizar un screening de una biblioteca de ADNc obtenida de hemolinfa mediante PCR usando cebadores degenerados obtenidos a partir de la secuencia de aminoácidos obtenida de la proteína purificada para así amplificar el ADNc. Sin embargo, dado que estos péptidos se sintetizan en forma de precursores para después convertirse en péptidos maduros mediante su procesamiento post-traduccional, la amplificación del ADNc usando cebadores obtenidos a partir de la secuencia del péptido maduro permite obtener únicamente un ADNc parcial que codifica la secuencia del péptido maduro pero que no se corresponde a la secuencia nucleotídica completa que codifica para el precursor de la proteína. En estos casos, es necesaria una segunda ronda de screening usando el ADNc parcial obtenido en el primer screening como sonda para identificar mediante hibridación en una segunda ronda de screening el ADNc completo de las miticinas y mitilinas (véase Mitta,G. et al., 1999, Eur. J. Biochem., 265:71-78).

Así, existe una necesidad en el arte de métodos más sencillos que permitan la obtención de ADNcs que codifiquen las secuencias completas de los precursores de las mitilinas y miticinas con el fin de simplificar el proceso global de obtención por via recombinante.

Los estudios realizados hasta la fecha con estas formas ya patentadas revelan la existencia de actividad frente a bacterias Gram positivas fundamentalmente, sin apreciarse especificidad de patógeno. Por tanto, es necesario trabajar en el desarrollo de nuevos compuestos alternativos y eficaces, que reduzcan al mínimo posible los problemas antes expuestos, y que puedan ser incluidos dentro de estrategias integradas para el control de las enfermedades durante el cultivo de estos moluscos.

Compendio de la invención

En un primer aspecto, la invención se relaciona con un método para la identificación de un ADNc que codifica el precursor de una miticina o una mitilina que comprende

        (i)        poner en contacto un mejillón un agente inmunogénico,

        (ii)        preparar librerías de ADNc de mejillones tratados con el agente inmunogénico

        (iii)        efectuar una sustracción de la librería obtenida de los mejillones tratados con una preparación de ácidos nucleicos de mejillones controles y

        (iv)        aislar los ADNcs específicos de mejillones tratados con el agente inmunogénico.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un ADNc identificado mediante un método de la invención.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una construcción génica que comprende un ácido nucleico de la invención.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico o una construcción génica de la invención que está operativamente acoplado con una secuencia que regula la expresión de dicho polinucleótido o de dicha construcción génica.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una célula hospedadora que contiene una construcción génica o un vector de acuerdo a la invención.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un polipéptido codificado por un ADNc de la invención.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la obtención de un polipéptido de la invención que comprende transformar una célula con un vector de la invención y recuperar el polipéptido del interior celular o del medio de cultivo.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la obtención de un polipéptido de la invención que comprende inyectar intramuscularmente en un mejillón un agente inmunogénico y recuperar posteriormente de la hemolinfa uno o varios de los polipéptidos.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un anticuerpo que reconoce específicamente el polipéptido de la invención.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende al menos un polipéptido de la invención y un carrier farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un polipéptido de la invención o con una composición farmacéutica de la invención para su uso en medicina.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de un polipéptido de la invención o de una composición de la invención para la preparación de un medicamento destinado a tratar una enfermedad infecciosa.

Descripción detallada de la invención

Los autores de la presente invención han conseguido desarrollar un método para la identificación de mitilinas y miticinas que permite obtener en un solo paso la secuencia completa del ADNc que codifica los precursores de dichos péptidos, facilitando así la posterior obtención de dichos péptidos de forma recombinante. Así, en un primer aspecto, la invención se relaciona con un método para la identificación de miticinas... [Seguir leyendo]

1. Método para la identificación de un ADNc que codifica el precursor de una miticina o una mitilina que comprende

        (i)        poner en contacto un mejillón un agente inmunogénico,

        (ii)        preparar librerías de ADNc de mejillones tratados con el agente inmunogénico

        (iii)        efectuar una sustracción de la librería obtenida de los mejillones tratados con una preparación de ácidos nucleicos de mejillones controles y

        (iv)        aislar los ADNcs específicos de mejillones tratados con el agente inmunogénico.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el agente inmunogénico está seleccionado del grupo de un cóctel de bacterias muertas, poli I:C y una mezcla de ambos.

3. Un ADNc identificado mediante un método según las reivindicaciones 1 ó 2.

4. Una construcción génica que comprende un ácido nucleico tal que definido en la reivindicación 3.

5. Un vector de expresión que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 3 o una construcción génica según la reivindicación 4 que está operativamente acoplado con una secuencia que regula la expresión de dicho polinucleótido o de dicha construcción génica.

6. Una célula hospedadora que contiene una construcción génica tal que definida en la reivindicación 4 o un vector tal que definido en la reivindicación 5.

7. Un polipéptido codificado por un ADNc según la reivindicación 3.

8. Un polipéptido según la reivindicación 7 seleccionado del grupo de

        (i)        un polipéptido que comprende una de las secuencias definidas en SEQ ID NO:1 a 19,

        (ii)        una variante del polipéptido según (i) que muestra una identidad en la secuencia aminoacídica de al menos 90% con los polipéptidos definidos en las secuencias de 1 a 16, y

        (iii)        una variante del polipéptido según (ii) que muestra una identidad en la secuencia aminoacídica de al menos 66% con los polipéptidos definidos en las secuencias 17 a 19.

9. Método para la obtención de un polipéptido según la reivindicación 7 u 8 que comprende transformar una célula con un vector según la reivindicación 5 y recuperar el polipéptido del interior celular o del medio de cultivo.

10. Método para la obtención de un polipéptido según la reivindicación 7 u 8 que comprende inyectar intramuscularmente en un mejillón un agente inmunogénico y recuperar posteriormente de la hemolinfa uno o varios de los polipéptidos.

11. Método según la reivindicación 10 en el que el agente inmunogénico está seleccionado del grupo de un cóctel de bacterias muertas, poli I:C y una mezcla de ambos.

12. Un anticuerpo que reconoce específicamente el polipéptido según las reivindicaciones 7 u 8.

13. Una composición farmacéutica que comprende al menos un polipéptido según la reivindicaciones 7 u 8 y un carrier farmacéuticamente aceptable.

14. Un polipéptido según la reivindicación 7 u 8 o una composición según la reivindicación 13 para su uso en medicina.

15. Uso de un polipéptido según la reivindicación 7 u 8 o de una composición según la reivindicación 13 para la preparación de un medicamento destinado a tratar una enfermedad infecciosa.

16. Uso según la reivindicación 15, en el que la enfermedad infecciosa es una infección por E. coli.

17. Uso según la reivindicación 15, en el que la enfermedad infecciosa es una necrosis pancreática infecciosa.