UN COMPLEJO POLIPEPTÍDICO FLUORESCENTE DE 40 A 500 NM DE TAMAÑO.

Un método para fabricar un complejo polipeptídico fluo-rescente esférico que se caracteriza por que un polipéptido fluorescente aislado es reticulado inter-molecularmente consigo mismo o con uno o más polipéptidos y donde dicho complejo es de 40 a 500 nm de tamaño,

de manera que el método comprende las etapas de a) aportar al menos un polipéptido fluorescente aisla-do y opcionalmente un segundo polipéptido b) añadir un reactivo reticulante químicoc) terminar la reacción una vez se haya obtenido un complejo polipeptídico del tamaño deseado, y d) aislar el complejo obtenido en la etapa (c)

La presente invención se refiere a un método para fa-bricar un complejo polipeptídico fluorescente esférico que se caracteriza por que un polipéptido fluorescente aislado es reticulado consigo mismo intermolecularmente o bien con uno o más polipéptidos y porque dicho complejo es de 40 nm 5 a 500 nm de tamaño. También hace referencia a un complejo que se puede obtener por dicho método, a los conjugados que comprenden dicho complejo polipeptídico fluorescente y al uso de dicho complejo o conjugado.

Los colorantes fluorescentes se encuentran entre las 10 clases de moléculas que se utilizan con mayor frecuencia y son realmente importantes en el etiquetado o marcado y en la detección de las biomoléculas. Dichos colorantes o mar-cadores fluorescentes se pueden clasificar en colorantes fluorescentes orgánicos de bajo peso molecular por un lado, 15 y en biomoléculas de medio a elevado peso molecular, las proteínas o polipéptidos fluorescentes por otro lado.

La sensibilidad que se puede conseguir, por ejemplo, en un inmunoanálisis usando un colorante fluorescente como un marcador depende considerablemente del número y de la 20 eficacia de las moléculas fluorescentes presentes en el elemento de enlace específico utilizado en el sistema de

detección, por ejemplo, en un anticuerpo utilizado en un inmunoanálisis. En general se acepta que exista una densi-dad más bien óptima baja de fluoróforos de peso molecular bajo que se puedan introducir en, por ejemplo, un anticuer-po. Esto es debido al hecho de que el sobre-marcaje provoca 5 efectos negativos como una elevada tinción del fondo, la extinción de la fluorescencia y/o un enlace reducido del anticuerpo con su antígeno.

Se han realizado grandes esfuerzos en la técnica que han conducido a una ligera mejoría en los métodos de detec-10 ción de fluorescencia. Un intento se ha centrado en el aco-plamiento de moléculas fluorescentes de bajo peso molecular a biopolímeros y el posterior acoplamiento de dichos bio-polímeros marcados a un elemento o miembro de un par de en-lace biológico, por ejemplo, a un anticuerpo. La patente 15 americana 4.169.137 revela que los reactivos de esqueleto polimérico polifuncional que contienen aminas primarias, por ejemplo, polietilenimina o poli-L-lisina se pueden uti-lizar para lograr un biopolímero que está marcado de forma intensiva con un colorante fluorescente de bajo peso mole-20 cular, por ejemplo, con un isotiocianato de fluoresceína, (FITC).

Los derivados de dextrano fluorescentes se han utili-zado para incrementar la intensidad de fluorescencia y en el comercio se dispone de numerosos derivados de dextrano 25 fluorescentes. Ver el “Handbook of fluorescent Probes and Research Chemicals, 6th edition, R.P. Haughland, Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg. 97402(1996). Los derivados de

dextrano fluorescentes constan de dextranos solubles (es decir, dextranos con un peso molecular de 10.000, 40.000, 70.000, 500.000 y 2.000.000 Daltons) conjugados con diver-sos colorantes fluorescentes como la fluoresceína, dansyl, rodamina y Rojo de Texas. Los grados de sustitución en es-5 tos derivados de dextrano fluorescentes son 1-2 moléculas de colorante por dextrano de 10.000 Daltons, 2-4 moléculas de colorante por dextrano de 40.000 Daltons, 3-6 moléculas de colorante por dextrano de 70.000 Daltons, aproximadamen-te 64 moléculas de colorante por dextrano de 500.000 Dal-10 tons, y unas 134 moléculas de colorante por dextrano de 2.000.000 Daltons. Grados superiores de sustitución tienden a conducir a la extinción de la fluorescencia y/o a unas interacciones no específicas. Los derivados de isotiociana-to de fluoresceína (FITC) de dextrano o de poli-L-lisina 15 con grados de sustitución que oscilan entre 0,003 y 0,020 moléculas de FITC por molécula de glucosa y entre 0,003 y 0,01 moléculas de FITC por molécula de residuo de lisilo se encuentran disponibles en el comercio procedentes de empre-sas como Sigma Chemical Company. 20

Otro intento por incrementar la intensidad de fluores-cencia utilizaba la rodamina como colorante fluorescente, ver Shechter, Y., et al., Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 75(1978)2135-2139. Se obtenían intensidades de fluorescen-cia superiores a las normales para hormonas peptídicas como 25 la insulina y un factor de crecimiento epidérmico por el enlace covalente de estos péptidos a las moléculas alfa-lactalbúmina que eran sustituidas por moléculas de rodamina

(por ejemplo, 7:1). Esto se realizaba mientras se mantenía afinidad de enlace de cada hormona por su receptor (que es uno de los requisitos básicos de cualquier procedimiento de marcaje).

Aumentar el número de moléculas o partículas de marca-5 je no siempre funciona. Por ejemplo, H.M. Shapiro describe un intento de incrementar las señales de fluorescencia Por Tomas Hirschfeld y cols., en Block Engineering, donde va-rios cientos de moléculas de fluoresceína se acoplaban a un polímero sintético, la polietilenimina, que luego se conju-10 gaba con un anticuerpo. El método no funcionaba porque la emisión de fluorescencia de las moléculas de fluoresceína se extinguía debido a las cortas distancias entre fluorófo-ros en la misma molécula de polímero. Ver “Practical Flow Cytometry”, tercera edición, H.M. Shapiro, Wiley-Liss, New 15 York, 1995, p.277.

Aunque obviamente es posible introducir una gran can-tidad de colorantes fluorescentes de bajo peso molecular en un conjugado deseado, el gran inconveniente incluso en la actualidad parece ser la extinción de la fluorescencia que 20 se produce si varias moléculas de colorante fluorescente de bajo peso molecular están demasiado próximas.

Un intento alternativo consiste en utilizar partículas de látex que se marcarán con moléculas de colorante fluo-rescentes de poco peso molecular. Las ventajas de dichas 25 microesferas marcadas se han descrito, por ejemplo, en US 5.516.635. Mientras que dichas partículas parecen aportar una mayor sensibilidad en los análisis, debido muy proba-

blemente a una extinción reducida de la fluorescencia, dichas partículas en ciertas configuraciones pueden tener al-gunos inconvenientes como dificultades en una producción reproducible de dichas partículas marcadas de látex, pro-blemas en estabilidad, alguna fuga de colorante fluorescen-5 te que sale de dichas partículas y unos efectos no deseados provocados por el propio látex en sí.

Los polipéptidos o las proteínas de medio a elevado peso molecular son bastante diferentes de los colorantes fluorescentes de bajo peso molecular anteriormente comenta-10 dos y por tanto requieren consideraciones y métodos distin-tos. Dicha proteína fluorescente puede transportar hasta 30 cromóforos por molécula. Por ejemplo, se ha descrito que la ficoeritrina (PE), un elemento de la familia de las ficobi-liproteínas, puede tener hasta 34 cromóforos asociados. Un 15 anticuerpo conjugado a la PE puede, por ejemplo, ser utili-zado en un inmunoanálisis en placa fluorescente y dicho análisis ha resultado ser bastante sensible (Custer, M.C., y Lotze, M.T., J. Immunol. Methods 128(1990) 109-117).

Las ficobiliproteínas son proteínas captadoras de luz 20 del grupo de los ficobilisomas anclados en los tilacoides de las cianobacterias y de las algas rojas. Estos recogen la energía de la luz visible y la canalizan al sistema fo-tosintético de la clorofila. Debido a sus excepcionales propiedades fotosintéticas son de gran interés en los pro-25 cedimientos para la detección de la fluorescencia.

Las biliproteínas comprenden normalmente 2 a 3 subuni-dades diferentes, donde las subunidades pueden oscilar en-

tre 10.000 y 60.000 Dalton en peso molecular.

Tal como se ha mencionado antes las ficobiliproteínas están comprendidas por 2 a 3 subunidades diferentes. Por ejemplo, la APC nativa consiste en 6 subunidades de ficobi-liproteínas que constituyen la 104-kDa ficobiliproteína 5 APC.

Se sabe que la APC nativa se disocia en subunidades monoméricas en la mayoría de las condiciones de análisis (por ejemplo, en el caso de una concentración tampón y/o proteínica baja). Esta inestabilidad por ejemplo en los 10 tampones fisiológicos representa un inconveniente importan-te del APC nativo.

Se ha descubierto que los preparados de APC pueden ser estabilizados mediante la reticulación intramolecular del APC. Los preparados de aloficocianina estabilizados y reti-15 culados (conocidos aquí como XL-APC) fueron desarrollados por Glazer...

1. Un método para fabricar un complejo polipeptídico fluo-rescente esférico que se caracteriza por que un polipéptido fluorescente aislado es reticulado inter-molecularmente consigo mismo o con uno o más polipéptidos y donde dicho 5 complejo es de 40 a 500 nm de tamaño, de manera que el método comprende las etapas de

a) aportar al menos un polipéptido fluorescente aisla-do y opcionalmente un segundo polipéptido

b) añadir un reactivo reticulante químico 10

c) terminar la reacción una vez se haya obtenido un complejo polipeptídico del tamaño deseado, y

d) aislar el complejo obtenido en la etapa (c)

2. El método de la reivindicación 1, en el que la proteína fluorescente se selecciona del grupo compuesto por la pro-15 teína fluorescente verde, la proteína fluorescente roja y una ficobiliproteína.

3. El método de la reivindicación 2, en el que la proteína fluorescente es una ficobiliproteína.

4. El método de la reivindicación 3, en el que la ficobili-20 proteína comprende subunidades α- y ß- unidas por un enlace covalente.

5. El método de la reivindicación 4, en el que la ficobili-proteína es la aloficocianina.

6. El complejo polipeptídico fluorescente esférico que se 25 puede obtener por cualquiera de los métodos conforme a la reivindicación 1 a 5.

7. Un conjugado que comprende el complejo conforme a las

reivindicaciones 6 y un elemento o miembro de un par de en-lace.

8. El conjugado de la reivindicación 7, en el que el miem-bro o elemento de un par de enlace se elige del grupo com-puesto por un anticuerpo y un hapteno. 5

9. Uso de un conjugado conforme a la reivindicación 7 o bien 8 en una valoración del enlace específica.

10. Uso de un complejo conforme a la reivindicación 6 como un marcador fluorescente.

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