Un ácido nucleico en un entorno distinto de su entorno natural cuya secuencia codifica una proteína fluorescente de un organismo antozoo sin bioluminiscencia seleccionado de los géneros Anemonia,

Clavularia y Discosoma, en que: (a) dicha proteína fluorescente es de Anemonia majano y dicho ácido nucleico puede amplificarse con un par de cebadores, el primero de los cuales consta de la secuencia de SEQ ID NO:36 y el segundo de los cuales consta de la secuencia de SEQ ID NO:37; o (b) dicha proteína fluorescente es de Clavularia sp. y dicho ácido nucleico puede amplificarse con un par de cebadores compuesto de un primer cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:38 y un segundo cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:40; o (c) dicha proteína fluorescente es de Zoanthus sp. y dicho ácido nucleico puede amplificarse con un par de cebadores compuesto de un primer cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:41 y un segundo cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:42; o (d) dicha proteína fluorescente es de Discosoma sp. "roja" y dicho ácido nucleico puede amplificarse con un par de cebadores compuesto de un primer cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:43 y un segundo cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:44; o (e) dicha proteína fluorescente es de Discosoma striata y dicho ácido nucleico puede amplificarse con un par de cebadores compuesto de un primer cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:45 y un segundo cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:46

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Campo de la invención

Esta invención se refiere al campo de la biología molecular. Más específicamente, esta invención se refiere a nuevas proteínas fluorescentes de especies sin bioluminiscencia de la clase de los antozoos, a procedimientos para la identificación de las secuencias de ADN que codifican las proteínas, a los genes que codifican dichas proteínas y a sus usos.

Descripción de la técnica relacionada

El marcaje fluorescente es una herramienta particularmente útil para marcar una proteína, célula u organismo de interés. Tradicionalmente, una proteína de interés se purifica y después se conjuga covalentemente con un derivado fluoróforo. Para los estudios in vivo, el complejo proteína-colorante se introduce después en las células de interés mediante micropipeteado o por un procedimiento de permeabilización reversible. Sin embargo, las etapas de unión y de introducción del colorante hacen que el procedimiento sea laborioso y difícil de controlar. Un procedimiento alternativo para el marcaje de proteínas de interés es la concatenación o fusión del gen que expresa la proteína de interés con un gen que expresa un marcador y la expresión posterior del producto de fusión. Los marcadores típicos para este procedimiento de marcaje de proteínas incluyen la -galactosidasa, la luciferasa de luciérnaga y la luciferasa bacteriana. Sin embargo, estos marcadores requieren sustratos exógenos o cofactores y, por lo tanto, son de uso limitado para estudios in vivo.

Un marcador que no requiere un cofactor o sustrato exógeno es la proteína verde fluorescente (GFP) de la medusa Aequorea victoria, una proteína con un máximo de excitación a 395 nm, un segundo pico de excitación a 475 nm y un máximo de emisión a 510 nm. La GFP es una proteína de 238 aminoácidos, en que los aminoácidos 65-67 están implicados en la formación del cromóforo.

Los usos de la GFP para el estudio de la expresión génica y la localización de proteínas se discuten en detalle por Chalfie y col. en Science 263 (1994), 802-805 y Heim y col. en Proc. Natl. Acad. Sci. 91 (1994), 1250112504. Adicionalmente, Rizzuto y col. discuten en Curr. Biology 5 (1995), 635-642, el uso de la GFP natural como herramienta de visualización de orgánulos subcelulares en células, mientras que Kaether y Gerdes describen en Febs Letters 369 (1995), 267-271, la visualización del transporte de proteínas a lo largo de la ruta de secreción mediante la GFP natural. La expresión de la GFP en células vegetales se discute por Hu y Cheng en Febs Letters 369 (1995), 331-334, mientras que la expresión de la GFP en embriones de Drosophila se describe por Davis y col. en Dev. Biology 170 (1995), 726-729.

Las estructuras cristalográficas de la GFP natural y de la GFP mutante S65T revelan que la estructura terciaria de la GFP se asemeja a un barril (Ormö y col., Science 273 (1996), 1392-1395; Yang y col., Nature Biotechnol. 14 (1996), 1246-1251). El barril consta de láminas  en una estructura compacta, en cuyo centro una hélice α que contiene el cromóforo queda protegida por el barril. La estructura compacta confiere gran estabilidad a la GFP en condiciones diversas y/o duras, como el tratamiento con proteasa, lo que hace que la GFP sea un indicador de gran utilidad, en general. Sin embargo, por su estabilidad, la GFP no es óptima para la determinación de sucesos a corto plazo o repetitivos.

Se está llevando a cabo gran cantidad de investigación para mejorar las propiedades de la GFP y para producir reactivos de GFP útiles y optimizados para diversos fines de investigación. Se han desarrollado nuevas versiones de la GFP, por ejemplo un ADN de GFP “humanizado” que produce una proteína cuya síntesis se incrementa en células de mamíferos (Haas y col., Current Biology 8 (1996), 315-324; Yang y col., Nucleic Acids Research 24 (1996), 4592-4593). Una proteína humanizada tal es la “proteína verde fluorescente mejorada” (EGFP). Otras mutaciones de la GFP han resultado en versiones que emiten luz azul, cian y verde amarillenta. Sin embargo, a pesar de la gran utilidad de la GFP, otras proteínas fluorescentes con propiedades similares o diferentes a las de la GFP serían de utilidad en la técnica. Nuevas proteínas fluorescentes resultan en la posibilidad de nuevos colores

o la producción de fluorescencia dependiente del pH. Otros beneficios de proteínas fluorescentes nuevas incluyen las posibilidades de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FERT) basadas en nuevos espectros y una mejor adecuación para mayor excitación.

En su tesis de diploma “Zur Biologie der Ökotypen von Anemonia sulcata (Pennant)”, 1996, Jörg Wiedenmann describe sus intentos de clasificar Anemonia sulcata según su entorno. Al hacer esto, el autor examina el hábitat, el color de los tentáculos, el genotipo y la agresividad del comportamiento. Al examinar el color de los tentáculos, el autor determina que este se debe en parte a zooxantelas y en parte a los colores propios de la anémona, que el autor describe como proteínas fluorescentes fijadas genéticamente.

La técnica anterior es deficiente en proteínas fluorescentes nuevas de las que se conozcan las secuencias codificantes de ADN. La presente invención satisface esta necesidad existente desde hace mucho tiempo en la técnica.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se dirige a un ácido nucleico en un entorno distinto de su entorno natural, cuya secuencia codifica una proteína fluorescente, en que dicha proteína fluorescente es una proteína de un organismo antozoo sin bioluminiscencia seleccionado de los géneros Anemonia, Clavularia, Zoanthus y Discosoma y en que:

(a) dicha proteína fluorescente es de Anemonia majano y dicho ácido nucleico puede amplificarse con un par de cebadores, el primero de los cuales consta de la secuencia de SEQ ID NO:36 y el segundo de los cuales consta de la secuencia de SEQ ID NO:37; o

(b) dicha proteína fluorescente es de Clavularia sp. y dicho ácido nucleico puede amplificarse con un par de cebadores compuesto de un primer cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:38 y un segundo cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:40; o

(c) dicha proteína fluorescente es de Zoanthus sp. y dicho ácido nucleico puede amplificarse con un par de cebadores compuesto de un primer cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:41 y un segundo cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:42; o

(d) dicha proteína fluorescente es de Discosoma sp. “roja” y dicho ácido nucleico puede amplificarse con un par de cebadores compuesto de un primer cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:43 y un segundo cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:44; o

(e) dicha proteína fluorescente es de Discosoma striata y dicho ácido nucleico puede amplificarse con un par de cebadores compuesto de un primer cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:45 y un segundo cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:46.

Se describe un procedimiento para la identificación de una secuencia de ADN codificante de una proteína fluorescente que comprende la etapa de cribado en busca de la existencia de una secuencia de ácido nucleico en una muestra, en que la secuencia de ácido nucleico codifica un péptido con una secuencia seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO:3, 5, 8, 11, 12 y 14. La existencia de la secuencia de ácido nucleico identifica la secuencia de ADN codificante de la proteína fluorescente.

También se describe un procedimiento para la identificación de una secuencia de ADN codificante de una proteína fluorescente que comprende la etapa de cribado en busca de la existencia de una secuencia de ácido nucleico en una muestra, en que la secuencia de ácido nucleico hibrida con un cebador seleccionado del grupo que consta de SEQ ID NO:4, 6, 7, 9, 10, 13, 15 y 16. La existencia de la secuencia de ácido nucleico identifica la secuencia de ADN codificante de la proteína fluorescente.

También se describe un procedimiento para el análisis de una proteína fluorescente en una célula que comprende las etapas de la expresión en la célula de una secuencia de ácido nucleico codificante de una proteína fluorescente con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO:55-63; y la medida de una señal fluorescente procedente de la proteína. Este procedimiento comprende además una etapa de clasificación de la célula según la señal. Preferentemente, la célula... [Seguir leyendo]

1. Un ácido nucleico en un entorno distinto de su entorno natural cuya secuencia codifica una proteína fluorescente de un organismo antozoo sin bioluminiscencia seleccionado de los géneros Anemonia, Clavularia y Discosoma, en que:

(a) dicha proteína fluorescente es de Anemonia majano y dicho ácido nucleico puede amplificarse con un par de cebadores, el primero de los cuales consta de la secuencia de SEQ ID NO:36 y el segundo de los cuales consta de la secuencia de SEQ ID NO:37; o

(b) dicha proteína fluorescente es de Clavularia sp. y dicho ácido nucleico puede amplificarse con un par de cebadores compuesto de un primer cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:38 y un segundo cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:40; o

(c) dicha proteína fluorescente es de Zoanthus sp. y dicho ácido nucleico puede amplificarse con un par de cebadores compuesto de un primer cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:41 y un segundo cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:42; o

(d) dicha proteína fluorescente es de Discosoma sp. “roja” y dicho ácido nucleico puede amplificarse con un par de cebadores compuesto de un primer cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:43 y un segundo cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:44; o

(e) dicha proteína fluorescente es de Discosoma striata y dicho ácido nucleico puede amplificarse con un par de cebadores compuesto de un primer cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:45 y un segundo cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:46.

2. Un ácido nucleico según la reivindicación 1, en que dicha proteína fluorescente es de Anemonia majano y dicho ácido nucleico puede amplificarse con un par de cebadores compuesto de un primer cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:36 y un segundo cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:37.

3. Un ácido nucleico según la reivindicación 1, en que dicha proteína fluorescente es de Clavularia sp. y dicho ácido nucleico puede amplificarse con un par de cebadores compuesto de un primer cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:38 y un segundo cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:40.

4. Un ácido nucleico según la reivindicación 1, en que dicha proteína fluorescente es de Zoanthus sp. y dicho ácido nucleico puede amplificarse con un par de cebadores compuesto de un primer cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:41 y un segundo cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:42.

5. Un ácido nucleico según la reivindicación 1, en que dicha proteína fluorescente es de Discosoma sp. “roja” y dicho ácido nucleico puede amplificarse con un par de cebadores compuesto de un primer cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:43 y un segundo cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:44.

6. Un ácido nucleico según la reivindicación 1, en que dicha proteína fluorescente es de Discosoma striata y dicho ácido nucleico puede amplificarse con un par de cebadores compuesto de un primer cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:45 y un segundo cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:46.

7. El ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en que dicho ácido nucleico está aislado.

8. Una construcción que comprende un vector y un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

9. Una célula transformada con un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

10. Un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en que la secuencia del ácido nucleico puede amplificarse con un cebador seleccionado del grupo que consta de SEQ ID NO:4, 6, 7, 9, 10, 13, 15 y 16.

11. Una proteína fluorescente codificada por el ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 presente en un entorno distinto de su entorno natural.