MÉTODO PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ESPECÍFICOS DE LA CLASE DE INMUNOGLOBULINA G (IgG).

Método para la detección de anticuerpos específicos de la clase de inmunoglobulina G (IgG) Esta invención se refiere a un método para la determinación de un analito en una muestra por medio de una valoración, que se puede realizar sin etapas de lavado en un formato de una sola etapa. Cuando en el sistema inmunológico del organismo de un animal mamífero entran cuerpos extraños, éste crea anticuerpos, llamados también inmunoglobulinas, que sirven paren cinco clases distintas. Inmunoglobulinas de clase M, G, A, E y D. Estas cinco clases de inmunoglobulinas se diferencian respectivamente en la composición de las cadenas pesadas, que se conocen como cadenas µ, , , o bien . Cada clase o tipo de inmunoglobulina tiene un cometido en el organismo. Las inmunoglobulinas de clase M actúan en un primer contacto con el antígeno produciéndose la llamada inmunización inicial. Sin embargo, la concentración de estas inmunoglobulinas disminuye rápidamente en el caso de una infección avanzada. Las inmunoglobulinas de clase G se forman al principio lentamente en una primera inmunización y actúan en grandes cantidades en el caso de una segunda infección con el mismo antígeno. Las inmunoglobulinas de clase A se pueden encontrar en las superficies de las mucosas del organismo y actúan en los procesos de defensa que allí tienen lugar. Las inmunoglobulinas de la clase E son responsables principalmente de las reacciones alérgicas. La función exacta de las inmunoglobulinas de la clase D es desconocida por el momento. Las distintas clases de inmunoglobulinas se pueden presentan en la sangre en concentraciones muy distintas. Así las inmunoglobulinas de clase G (IgG) en suero humano normal con un porcentaje de aproximadamente el 75%, lo que corresponde a un contenido en suero de 8 hasta 18 mg/ml, son la clase más frecuente. La inmunoglobulina en segundo lugar de frecuencia es la IgA, cuya concentración media en suero es de 0,9 hasta 4,5 mg/ml. Las inmunoglobulinas de clase M existen en una concentración de 0,6 hasta 2,9 mg/ml, las inmunoglobulina de clase D en una concentración de 0,03 hasta 0,4 mg/ml. El porcentaje inferior corresponde a los anticuerpos de IgE, que solamente aparecen en suero en una concentración de 0,02 hasta 0,05 µg/ml. En la tecnología actual se han descrito diferentes métodos para la detección de anticuerpos de una clase determinada específicos para un antígeno. Asi con frecuencia se realiza la detección en una muestra de anticuerpos de una clase determinada específicos para un antígeno de manera que los anticuerpos específicos están enlazados a una fase sólida revestida de un antígeno específico. La detección de las inmunoglobulinas (Ig) enlazadas ahora a la fase sólida, específicas para el antígeno, se realiza mediante el enlace de los anticuerpos, que se dirigen específicamente contra la Ig humana de una clase determinada, a la molécula Ig que se va a detectar. Los anticuerpos dirigidos contra la Ig humana se han previsto con un etiquetado o marca a través del cual se realiza la detección. Dicha guía de prueba (formato de prueba indirecto) solamente es posible cuando antes de la reacción se elimina la Ig no enlazada con los anticuerpos marcados dirigidos contra la Ig humana. Por lo tanto en este formato no es posible una guía de prueba de un solo paso como la necesaria para los sistemas automatizados. El llamado test o prueba del puente plantea una posibilidad a la hora de realizar una prueba en una sola etapa para la detección de anticuerpos. El concepto del test del puente se ha descrito en EP-A-0 280 211. Un primer compañero de enlace, que es capaz de estar enlazado específicamente con un anticuerpo determinado, como por ejemplo un antígeno, está unido o enlazado a una fase sólida. El anticuerpo que se va a determinar se une al antígeno enlazado a la fase sólida. En el lote de prueba existe además otro antígeno específico que está dotado de una marca o etiqueta. La detección del anticuerpo se realiza a través de la marca. SIempre que existen en la muestra inmunoglobulinas de clases distintas pero de la misma especificidad, la prueba no plantea diferencias entre las distintas clases. La EP 0 944 838 B1 publica un método de detección con la prueba del puente que facilita o permite la determinación selectiva de anticuerpos IgG específicos del antígeno en una muestra que también presenta anticuerpos IgM con la misma especificidad. Para ello se emplea el antígeno en forma monomérica. El antígeno monomérico actúa de manera que los anticuerpos IgM no pueden reaccionar o bien solo débilmente, con la misma especificidad. Las detecciones específicas de anticuerpos tienen una gran importancia en la serología de la infección, en la que se detecta la respuesta inmunológica contra estructuras antígenas de los agentes patógenos. Aunque existen diferentes fuentes de obtención de antígenos del virus (expresión recombinante en sistemas procariónticos y eucariónticos; cultivo controlado de virus, obtención de antígenos de fuentes naturales) no siempre es posible obtener antígenos en forma monomérica para poder realizar un inmunoanálisis selectivo de IgG en formato de una sola etapa. La EP 0 957 360 B1 describe la utilización de factores reumáticos para reducir el efecto Hook o gancho en el método para determinar un analito. La EP 1 098 198 A1 describe un inmunoanálisis para la determinación de anticuerpos IgG humanos. Para ello se emplea un anticuerpo monoclonal determinado el cual se dirige contra un epítopo de conformación del fragmento Fc del IgG humano enlazado a un antígeno. Este anticuerpo se emplea para la detección selectiva de IgG y se puede diferenciar entre los IgG que se enlazan a un antígeno y los IgG que no se unen a ningún antígeno. La presencia de 2   IgG no enlazado interfiere y conduce a pérdidas de señal. La EP 1 653 233 A1 describe un método de prueba o análisis para determinar anticuerpos específicos de los antígenos de la clase IgG, donde una muestra se pone en contacto con una fase sólida a la que están unidos los antígenos. En este método se emplea un anticuerpo monoclonal que distingue entre inmunoglobulinas enlazadas de forma no específica a la fase sólida e inmunoglobulinas enlazadas al antígeno. Tras la puesta en contacto de la muestra con la fase sólida se lava y después se aplica el anticuerpo monoclonal. Un inmunoanálisis que se realiza con un dispositivo de análisis automático para la detección de la inmunoglobulina G específica del antígeno en formato de una sola fase se ha descrito en WO 99/15898 (Chien et al). Se emplea un anticuerpo que es específico para la parte o el porcentaje constante de la inmunoglobulina G humana. En esta valoración son significativas las interferencias por la IgG libre, no específica sin discriminación suficiente de la IgG libre y de la IgG que forma complejos. Yin y cols. (Anal. Chem. 2005, 77:3525-3530) describen una prueba o ensayo inmunológico Sandwich para la detección de la IgG. Klaassen y cols (British Journal of Haematology, 1991:77:398-402) publican un método para la determinación de un anticuerpo específico del antígeno de la clase de inmunoglobulinas G. Se detecta un inmunocomplejo bivalente con un receptor enlazado a la fase sólida (C1q) y un segundo receptor (anticuerpo marcado 125l) Boas (Biophotonics International, April 2005, 60-61) publica una prueba o ensayo inmunológico Sandwich para la detección de ligandos difundibles derivados de los amiloides con ayuda de un anticuerpo, que es específico para oligómeros beta de amiloides. Los métodos de una sola etapa de la tecnología actual para detectar IgG pueden diferenciar entre IgG enlazada y libre de forma insuficiente. Para conseguir una discriminación entre IgG e IgM de la misma especificidad, los antígenos deben ser monómeros, y este es un requisito que no siempre se cumple. El cometido de la presente invención consistía en desarrollar un método para la detección de un analito en una muestra, en particular de anticuerpos específicos del antígeno de la clase de inmunoglobulina G, que se pueda llevar a cabo en una sola etapa, para poder ser empleado preferiblemente en sistemas automatizados. Además la presente invención tiene el cometido de superar al menos parcialmente los inconvenientes de la tecnología actual. Por ello es necesaria una discriminación suficiente entre los analitos libres y los analitos enlazados. En un primer aspecto la presente invención hace referencia a un método para la determinación de un analito en una muestra, que incluye los pasos siguientes: (a) puesta en contacto de la muestra con un primer receptor específico del analito y un segundo receptor específico del analito, de manera que uno de los dos receptores está unido a una fase sólida o bien es capaz de enlazarse a una fase sólida y el otro receptor lleva un grupo que emite... [Seguir leyendo]

1. Método para la determinación de un analito en una muestra, que engloba las etapas: (a) puesta en contacto de la muestra con un primer receptor específico del analito y un segundo receptor específico del analito, de manera que uno de los dos receptores está unido a una fase sólida o bien es capaz de enlazarse a una fase sólida y el otro receptor lleva un grupo que emite una señal o bien es capaz de unirse a un grupo que emite una señal, y (b) detección de la existencia o/y la cantidad de analito mediante la determinación del grupo que emite una señal en la fase sólida, que se caracteriza, por que el primer receptor específico del analito contiene al menos dos lugares de enlace para el analito y el segundo receptor específico del analito está unido a una disposición de al menos dos moléculas de analito, que están unidas al primer receptor, y puede distinguir esta disposición de una molécula de analito individual y el analito es un anticuerpo específico del antígeno. 2. Método conforme a la reivindicación 1, que se caracteriza por que el analito es un anticuerpo específico del antígeno de la clase de inmunoglobulina G. 3. Método conforme a la reivindicación 1 ó 2, que se caracteriza por que el primer receptor contiene al menos dos puntos de enlace distintos, al menos dos puntos o lugares de enlace iguales o una combinación de lugares de enlace distintos e iguales para los analitos, que preferiblemente el primer receptor es un receptor oligomérico o un receptor multimérico. 4. Método conforme a una de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza por que el primer receptor incluye un antígeno, que al menos tiene dos epítopos como lugares de enlace para los analitos. 5. Método conforme a una de las reivindicaciones anteriores, de manera que el primer receptor se dispone en forma de precursores del receptor. 6. Método conforme a la reivindicación 5, donde los precursores del receptor se crean de manera que durante o antes de la etapa (a) se pueden asociar o bien enlazar unos con otros para formar el primer receptor. 7. Método conforme a una de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza por que el segundo receptor es un anticuerpo similar al factor reumático. 8. Método conforme a una de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza por que el segundo receptor es un anticuerpo con al menos dos paratopos. 9. Método conforme a una de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza por que el segundo receptor es un anticuerpo con afinidad baja y elevada avididad hasta los analitos. 10. Método conforme a una de las reivindicaciones anteriores, donde la etapa (a) se lleva a cabo en un lote de reacción sin etapa de lavado. 11. Método conforme a una de las reivindicaciones anteriores, que es un método diagnóstico. 12. Kit o estuche que comprende un primer receptor específico del analito y un segundo receptor específico del analito, de manera que uno de los dos receptores está unido a una fase sólida o es capaz de unirse a una fase sólida y el otro receptor lleva un grupo emisor de una señal o es capaz de unirse a un grupo emisor de una señal, que se caracteriza por que el primer receptor específico del analito tiene al menos dos lugares de enlace para los analitos y el segundo receptor específico del analito se une a una configuración de al menos dos moléculas de analito, que están unidas al primer receptor, y esta disposición puede diferenciarse de una molécula de analito individual y el analito es un anticuerpo específico del antígeno. 13. Kit o estuche conforme a la reivindicación 12, de manera que el primer receptor específico del analito y el segundo receptor específico del analito son formulados para ser utilizados en un lote de reacción. 14. Utilización de un receptor específico del analito, que contiene al menos dos lugares de enlace para los analitos, en un método para la determinación de un analito en una muestra conforme a una de las reivindicaciones 1 hasta 11. 15. Utilización conforme a la reivindicación 14 en un método diagnóstico. 13