DETECCIÓN DE INFECCIONES PRIMARIAS POR PATÓGENOS.

La presente invención se refiere a polipéptidos de fusión adecuados como antígenos de ensayo en la detección de infecciones por patógenos, particularmente de infecciones primarias por patógenos. Además, la invención se refiere a métodos para detectar y determinar diferencialmente los anticuerpos IgM resultantes de una infección por un patógeno. Además, se proporcionan los reactivos de ensayo para llevar a cabo dichos métodos. Aparte de la tecnología de PCR, los ensayos inmunológicos todavía desempeñan un importante papel en la serología de la infección. Mediante la determinación específica de las diferentes clases de inmunoglobulina, la inmunología permite analizar el estadio de una enfermedad. Mediante la determinación de los títulos de IgM y de IgG frente a determinados antígenos víricos, resulta posible distinguir entre diferentes estadios de infección, por ejemplo infecciones agudas, infecciones recurrente, infecciones crónicas/persistentes o estadios de enfermedad postinfecciosos. Por ejemplo, las moléculas de IgG contra las glucoproteínas víricas únicamente se generan en un estadio tardío de una infección por citomegalovirus (Schoppel et al. JID 175:533-544, 1997; Eggers et al., J. Med. Virol. 63:135-142, 2001). Un aspecto crucial de una detección específica fiable de IgG e IgM en presencia de la otra clase de inmunoglobulina respectiva es la concentración efectiva de epítopos o la densidad efectiva de epítopos del antígeno de detección. Una concentración de epítopos efectiva elevada se refiere a una densidad de epítopos elevada y a que todos los epítopos son accesibles a la unión de anticuerpos. En contraste con lo anterior, también los agregados de polipéptidos presentan una elevada concentración de epítopos, aunque la concentración efectiva de epítopos es reducida debido a que los epítopos se encuentran parcial o completamente enterrados u ocultos y de esta manera no resultan accesibles a la unión de anticuerpos. Las concentraciones elevada de epítopos son una precondición para un reconocimiento específico de IgM, mientras que las concentraciones reducidas de epítopos son una precondición para el reconocimiento específico de IgG. En un ensayo clásico de IgM de tipo sándwich, que detecta moléculas de IgM contra el antígeno A, se utiliza un antígeno multimérico A como antígeno de captura inmovilizado. El mismo antígeno multimérico A que porta un grupo informador se utiliza como antígeno de detección. El analito IgM se une al antígeno de captura y al antígeno de detección, de manera que el grupo informador queda inmovilizado en una fase sólida (por ejemplo perlas recubiertas de estreptavidina). Con el fin de evitar interferencias de las moléculas de IgG dirigidas contra A, se añade al ensayo un antígeno monomérico A no marcado como agente de eliminación de interferencias (patente WO nº 98/123955, patente US nº 6.489.129 B1). De acuerdo con lo anterior, un ensayo específico de IgG de tipo sándwich (patentes WO nº 98/123961, US nº 6.645.732 B1) puede comprender un antígeno monomérico para la detección de IgG y un antígeno multimérico no marcado para evitar las interferencias con IgM. El principio que permite una detección específica de moléculas de IgM y de IgG se basa en sus estructuras moleculares respectivas. La IgM pentamérica presenta diez paratopos idénticos para la unión de antígenos, mientras que la IgG monomérica presenta únicamente dos sitios de unión en cada molécula. La detección de IgG se basa en la afinidad para el analito, mientras que la detección de IgM se basa en su avidez. En el primer caso, la unión se consigue mediante una interacción de alta afinidad entre epítopo y paratopo (es decir, sitio de unión de antígeno IgG); en el último caso, se consigue mediante una potenciación cooperativa de varias interacciones de baja afinidad ("avidez" se refiere a que las constantes individuales de disociación no se suman sino que se multiplican, es decir, una interacción relativamente débil, con una kD de ~10 -5 M resulta incrementada por dos sucesos independientes de unión, rindiendo una interacción de alta afinidad, con una kD de ~ 10 -10 M). De esta manera, puede afirmarse como regla general que los antígenos monoméricos se utilizan para la detección de IgG y se utilizan antígenos oligoméricos/multiméricos para la detección de IgM. La oligomerización o multimerización de antígenos puede conseguirse mediante entrecruzamiento químico de antígenos monoméricos con entrecruzantes homobifuncionales o heterobifuncionales. Generalmente, la oligomerización o multimerización puede optimizarse mediante el ajuste de las condiciones de reacción (concentración de proteínas y entrecruzante, pH, temperatura, tasa de agitación y tiempo de reacción), lo que consume mucho tiempo y resulta laborioso. Sin embargo, pueden alcanzarse diferentes grados de entrecruzamiento en diferentes lotes, lo que requiere procedimientos posteriores de fraccionamiento y/o de calibración. Además, un grado más alto de entrecruzamiento normalmente conduce a una reducción de la solubilidad, conduciendo a problemas en el rendimiento del ensayo. De esta manera, se desea encontrar un método mejorado para proporcionar antígenos multiméricos de un modo definido y reproducible. La patente US nº 6.207.420 describe una secuencia de fusión que comprende una proteína portadora que comprende una proteína de E. coli que presenta una probabilidad de solubilidad predicha de por lo menos 90% fusionada con un péptido o proteína heteróloga diana. Preferentemente, el péptido o proteína heteróloga normalmente es insoluble al expresarse en bacterias. La patente WO nº 03/000878 describe una proteína de fusión que comprende por lo menos un polipéptido diana y cadena arriba del mismo por lo menos un chaperón de FKBP, que se selecciona de entre el grupo que consiste de 2   FkpA, SlyD y factor inductor. El polipéptido diana puede ser un producto génico de mamífero o un producto génico de un patógeno de mamífero. Un primer aspecto de la invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende: (i) por lo menos un dominio de multimerización y (ii) una pluralidad de copias de un segmento de epítopo procedente de un patógeno, en el caso de que el dominio de multimerización sea un chaperón procariótico o eucariótico seleccionado de entre el grupo que consiste de FkpA, Skp, SecB, Hsp25, MIP, GroEL, ClpB y ClpX. Las moléculas de polipéptido de fusión son capaces de formar un multímero. Un multímero comprende una pluralidad de subunidades monoméricas asociadas mediante interacciones no covalentes a través del dominio de multimerización. El multímero puede formarse mediante, por ejemplo, incubación de moléculas de polipéptido de fusión bajo condiciones adecuadas. Los polipéptidos de fusión de la presente invención son fusiones genéticas que pueden producirse en cantidades elevadas y calidad reproducible según métodos estándares. Los polipéptidos de fusión y los multímeros formados a partir de los mismos presentan elevadas estabilidad y solubilidad y de esta manera son antígenos de ensayo excelentes en métodos para detectar anticuerpos que resultan de una infección por un patógeno. Preferentemente, los polipéptidos de fusión se utilizan en una determinación de anticuerpos IgM, más preferentemente en una determinación diferencial de anticuerpos IgM, todavía más preferentemente en una determinación diferencial de anticuerpos IgM tempranos que se producen en una infección aguda y/o primaria. Los polipéptidos de fusión pueden portar grupos informadores y/o grupos de captura y de esta manera pueden utilizarse como antígenos de detección y/o de captura. Además, los polipéptidos de fusión también resultan adecuados como agentes de eliminación de interferencias. Las moléculas de polipéptido de fusión de la presente invención preferentemente comprenden uno o dos dominios de multimerización, más preferentemente un dominio de multimerización. El dominio de multimerización preferentemente se localiza en el extremo N-terminal y/o C-terminal del polipéptido de fusión, más preferentemente en el extremo N-terminal. El dominio de multimerización es una secuencia polipeptídica que permite la multimerización de molécula individuales de polipéptido de fusión, en la que se forma un multímero que comprende una pluralidad de subunidades monoméricas, que se asocian mediante interacciones no covalentes. Las subunidades monoméricas del complejo son proteínas de fusión genética, en el que los residuos aminoácidos individuales se unen mediante enlaces peptídicos. Las subunidades monoméricas del multímero preferentemente son idénticas. Por ejemplo, el dominio de multimerización puede ser un dominio de dimerización, es decir, un dominio que permite la asociación no... [Seguir leyendo]

(ii) una pluralidad de copias de un segmento de epítopo procedente de un patógeno, en el caso de que el dominio de multimerización sea un chaperón procariótico o eucariótico seleccionado de entre el grupo que consiste de FkpA, Skp, SecB, Hsp25, MIP, GroEL, ClpB y ClpX. 2. Polipéptido según la reivindicación 1, que comprende por lo menos 2 copias de dicho segmento epítopo. 3. Polipéptido según la reivindicación 1 ó 2, en el que la longitud de un segmento epítopo es de entre 5 y 120 aminoácidos. 4. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que los segmentos epítopos se encuentran separados por secuencias espaciadoras. 5. Polipéptido según la reivindicación 4, en el que las secuencias espaciadoras presentan una longitud de entre 1 y 10 aminoácidos. 6. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el segmento epítopo comprende un epítopo que resulta reconocido específicamente por anticuerpos presentes en una etapa temprana o aguda de un infección por dicho patógeno. 7. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el segmento epítopo comprende un epítopo que resulta reconocido específicamente por anticuerpos presentes en una etapa tardía de un infección por dicho patógeno o en una infección pasada. 8. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el segmento epítopo comprende un epítopo que resulta reconocido específicamente por anticuerpos presentes en una infección persistente o recurrente por dicho patógeno. 9. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho segmento epítopo procede de un patógeno vírico, bacteriano o protozoario. 10. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el organismo patogénico se selecciona de entre el grupo que consiste de: (i) virus herpes tales como los virus humanos del Herpes simplex de tipos 1 y 2 (HHV1 y HHV2), el virus de la varicela zóster (HHV3), el virus de Epstein-Barr (HHV4/EBV) o el citomegalovirus humano (HHV5) y los virus humanos del herpes de tipos 6, 7 y 8, (ii) el virus de la rubéola, (iii) los virus de la hepatitis, tales como el virus de la hepatitis A (VAH), el virus de la hepatitis B (VHB) y el virus de la hepatitis C (VHC), (iv) paramixovirus tales como el virus del sarampión y el virus de la parotiditis, (v) un organismo Toxoplasma y (vi) un organismo Borrelia. 11. Polipéptido según la reivindicación 10, en el que el patógeno se selecciona de entre los patógenos asociados a riesgos durante el embarazo. 12. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que porta por lo menos un grupo informador y/o de acoplamiento. 13. Polipéptido según la reivindicación 12, que porta un grupo biotina de acoplamiento. 14. Polipéptido según la reivindicación 12, que porta un grupo informador de electroquimioluminiscencia o un grupo informador hapteno. 15. Polipéptido de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que se encuentra presente en forma de multímero. 31   16. Molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14. 17. Ácido nucleico según la reivindicación 16, en el que las partes del mismo codificantes de segmentos epítopos idénticos presentan una secuencia de nucleótidos diferente dentro del alcance de la degeneración del código genético. 18. Vector de expresión que comprende por lo menos un ácido nucleico según la reivindicación 16 ó 17 operativamente ligado a una secuencia de control de la expresión. 19. Célula huésped transfectada o transformada con una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 16 ó 17 ó un vector de expresión según la reivindicación 18. 20. Método para preparar un polipéptido de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que comprende las etapas: (i) proporcionar una célula huésped según la reivindicación 19, (ii) cultivar dicha célula huésped bajo condiciones en las que se expresa el polipéptido de fusión, y (iii) recuperar dicho polipéptido de fusión. 21. Método para preparar el polipéptido de fusión multimérico según la reivindicación 15, que comprende asociar una pluralidad de polipéptidos de fusión monoméricos bajo condiciones adecuadas para formar el multímero. 22. Utilización de un polipéptido de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 como reactivo de detección en un método para detectar un anticuerpo en una muestra. 23. Utilización según la reivindicación 22, en la que dicho anticuerpo es un anticuerpo IgM. 24. Utilización según la reivindicación 23 para la determinación diferencial de un anticuerpo IgM. 25. Utilización según la reivindicación 23 ó 24, en la que dicho anticuerpo es un anticuerpo IgM presente en una etapa temprana o aguda de una infección. 26. Utilización de un polipéptido de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 como reactivo de eliminación de interferencias en un método para detectar un anticuerpo en una muestra. 27. Utilización según la reivindicación 26, en la que dicho anticuerpo es un anticuerpo IgG. 28. Kit de reactivos de ensayo para detectar un anticuerpo en una muestra, que comprende por lo menos un polipéptido de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 y componentes de ensayo adicionales. 29. Reactivo de ensayo según la reivindicación 28, en el que dicho polipéptido de fusión es un reactivo de detección. 30. Reactivo de ensayo según la reivindicación 28, en el que dicho polipéptido de fusión es un agente de eliminación de interferencias. 31. Método para detectar un anticuerpo dirigido contra un patógeno en una muestra, que comprende las etapas: (i) incubar dicha muestra con un reactivo de ensayo que comprende por lo menos un polipéptido de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 y componentes de ensayo adicionales, y (ii) determinar la presencia y/o concentración de dicho anticuerpo en dicha muestra mediante la evaluación de la reacción de los componentes de la muestra con el reactivo de ensayo. 32. Método según la reivindicación 31, en el que dicho reactivo de ensayo comprende un reactivo de detección y por lo menos un reactivo de eliminación de interferencias, y la etapa (ii) comprende determinar la reacción de componentes de la muestra deseados con el reactivo de detección, en el que los componentes de la muestra no deseados resultan capturados por el reactivo o reactivos de eliminación de interferencias. 33. Método según la reivindicación 31 ó 32, en el que dicho anticuerpo que debe detectarse es un anticuerpo IgM presente en una etapa temprana o aguda de una infección primaria y el reactivo de ensayo comprende por lo menos un polipéptido de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, que porta un grupo 32   informador y/o de acoplamiento. 34. Método según la reivindicación 33, en el que el reactivo de ensayo comprende además un reactivo de eliminación de interferencias para capturar anticuerpos IgG y/o un reactivo de eliminación de interferencias para capturar anticuerpos IgM presentes en una etapa tardía de una infección y/o en una infección recurrente. 35. Método según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 34, en el que el reactivo de ensayo comprende un primer polipéptido de fusión que porta un grupo informador y un segundo polipéptido de fusión que porta un grupo de acoplamiento para la inmovilización en una fase sólida, y en el que el anticuerpo se determina mediante la formación de un complejo con el primer y segundo polipéptidos de fusión y detectando dicho complejo en dicha fase sólida. 36. Método según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 34, en el que el reactivo de ensayo comprende un polipéptido de fusión que porta un grupo de acoplamiento para la inmovilización en una fase sólida y un receptor que reconoce el anticuerpo que debe determinarse que porta un grupo informador, y en el que el anticuerpo se determina mediante la formación de un complejo con el polipéptido de fusión y el receptor en dicha fase sólida. 37. Método según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 34, en el que el reactivo de ensayo comprende un polipéptido de fusión que porta un grupo informador y un receptor que reconoce el anticuerpo que debe determinarse que porta un grupo de acoplamiento para la inmovilización en una fase sólida, y en el que el anticuerpo se determina mediante la formación de un complejo con el polipéptido de fusión y el receptor en dicha fase sólida. 38. Método para detectar diferencialmente un anticuerpo IgM dirigido contra un patógeno en una muestra, en la que la muestra puede comprender un anticuerpo interfiriente seleccionado de entre un anticuerpo IgM interfiriente y/o un anticuerpo IgG interfiriente, comprendiendo las etapas: (a) incubar dicha muestra con un reactivo de ensayo, que comprende: (i) por lo menos un receptor R 1 que se une específicamente a anticuerpos IgM, en el que R 1 es un antígeno multimérico o un anticuerpo anti-IgM humana, y (ii) por lo menos un receptor R 2 , que se une específicamente al anticuerpo IgM que debe detectarse diferencialmente, en el que R 2 es un polipéptido de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 y porta un grupo informador, (b) permitiendo la formación de un complejo que comprende R 1 , dicho anticuerpo IgM que debe detectarse diferencialmente y R 2 , portando dicho complejo un grupo informador, y (c) determinar dicho grupo informador unido con R 2 a dicho anticuerpo IgM que debe detectarse diferencialmente a modo de medida de dicho anticuerpo IgM en dicha muestra. 39. Método según la reivindicación 38, en el que el anticuerpo IgM que debe detectarse es un anticuerpo IgM presente en una etapa temprana o aguda de una infección, y en el que el anticuerpo IgM interfiriente es un anticuerpo IgM presente en una etapa tardía de una infección o en una infección pasada y/o un anticuerpo IgM presente en una infección persistente o recurrente. 40. Método según la reivindicación 39, en el que el receptor R 2 comprende por lo menos 6 copias de epítopo reconocidas por el anticuerpo IgM que debe detectarse. 41. Método según cualquiera de las reivindicaciones 38 a 40, en el que el receptor R1 porta un grupo de acoplamiento para la inmovilización en una fase sólida. 42. Reactivo de ensayo para detectar diferencialmente un anticuerpo IgM dirigido contra un patógeno en una muestra, en el que la muestra puede comprender un anticuerpo interfiriente seleccionado de entre un anticuerpo IgM interfiriente y/o un anticuerpo IgG interfiriente, comprendiendo: (i) por lo menos un receptor R 1 que se une específicamente a anticuerpos IgM, en el que R 1 es un antígeno multimérico o un anticuerpo anti-IgM humana, y (ii) por lo menos un receptor R 2 , que se une específicamente al anticuerpo IgM que debe detectarse diferencialmente, en el que R 2 es un polipéptido de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 y porta un grupo informador. --- 33   34     36