ANTÍGENOS DE GRUPO SANGUÍNEO DE DIFERENTES TIPOS PARA APLICACIONES DIAGNÓSTICAS Y TERAPÉUTICAS.

Antígenos de grupo sanguíneo de diferentes tipos para aplicaciones diagnósticas y terapéuticas CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere de manera general a composiciones para el tratamiento o la prevención del rechazo a injertos mediado por anticuerpos y, más particularmente, a composiciones que incluyen determinantes de grupo sanguíneo útiles para extraer los anticuerpos contra los antígenos de grupo sanguíneo. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Ya en los inicios del trasplante, se encontraba que el trasplante renal a través de las barreras ABO produce una alta incidencia de trasplantes que no llegan a ser funcionales, y por tanto el cumplimiento de las reglas tradicionales de Landsteiner usadas para la transfusión de sangre se contemplaba como un requisito previo en alotrasplante. Las isoaglutininas preformadas anti-A/B del receptor son responsables del rechazo hiperagudo de injertos con incompatibilidad ABO. Este rechazo hiperagudo es similar al observado en pacientes aloinmunizados con anticuerpos reactivos al HLA del donante. El primer intento de atravesar la barrera ABO en trasplantes se inició a principios de 1970, injertando riñones procedentes de un cadáver del grupo sanguíneo A2 a receptores O. 1 En la década de los 80, usando donantes A1 y B, Alexandre llevó a cabo la primera serie de trasplantes renales de donantes vivos (DV) con incompatibilidad ABO y obtuvo una supervivencia al injerto similar a la de los casos con compatibilidad ABO. El protocolo inmunosupresor englobaba plasmaféresis preoperatoria para extraer los anticuerpos anti-A/B, la transfusión de las plaquetas del donante, esplenectomía y terapia de inducción con globulinas anti-linfocitos/timocitos, inyección de sustancias del grupo sanguíneo A o B extraídas del estómago del cerdo y ciclosporina-azatioprina-prednisona. Desde entonces, en todo el mundo se ha informado de más de 500 casos de trasplantes renales de DV con incompatibilidad ABO, principalmente en Japón (revisado en 1 ), y ha sido bien documentada la importancia de reducir los niveles de anticuerpo anti-A/B en el receptor. 2,3 La supervivencia al injerto en esta serie es buena (1 año de supervivencia al injerto en el 85% aproximadamente de los donantes A1 y B) pero ligeramente inferior a la de los injertos con compatibilidad ABO debido a casos aislados de rechazo severo mediado por anticuerpos anti-A/B. 4,5 Datos recientes sobre trasplantes renales con incompatibilidad ABO usando un anticuerpo anti-CD20 (Rituximab) combinado con la extracción de anticuerpos han demostrado ser incluso mejores con respecto a la supervivencia al injerto. 6,7 El documento US 2003/0073822 se refiere a polipéptidos de fusión, y su uso en el tratamiento del rechazo a injertos mediado por anticuerpos. Las fusiones comprenden epítopos del grupo sanguíneo expresados sobre esqueletos proteicos de tipo mucina. En momentos de gran escasez de órganos, un mayor uso de injertos procedentes de donantes con incompatibilidad ABO permitirá la realización de un mayor número de trasplantes de riñón de DV. Además, la experiencia adquirida en este campo también será aplicable en el tratamiento previo y en la gestión después del trasplante de pacientes sensibilizados por el HLA. 8 RESUMEN DE LA INVENCIÓN La invención se basa, en parte, en composiciones y procedimientos mejorados para la extracción de los anticuerpos contra antígenos de grupo sanguíneo a partir del plasma y un procedimiento de tipado de la sangre. En un aspecto la invención proporciona una composición que comprende antígenos de grupo sanguíneo que incluyen: A tipo 1 GalNAc1,3(Fuc1,2)Galß1,3GlcNAcß1-R, A tipo 2 GalNAc1,3(Fuc1,2)Galß1 4GlcNAcß1-R, A tipo 3 GalNAc1,3(Fuc1,2)Galß1,3GalNAc1-R, A tipo 4 GalNAc1,3(Fuc1,2)Galß1,3GalNAcß1-R, B tipo I Gal1,3(Fuc1,2)Galß1,3GlcNAcß1-R, B tipo 2 Gal1,3(Fuc1,2)Galß1,4GlcNAcß1-R, B tipo 3 Gal1,3(Fuc1,2)Galß1,3GalNAc1-R, y B tipo 4 Gal1,3(Fuc1,2)Galß1,3GalNAcß1-R 2   en los que R representa un punto adecuado para su unión a un soporte sólido. En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para la determinación de la presencia de anticuerpos de grupo sanguíneo en una muestra procedente de un sujeto (por ejemplo, tipado de la sangre), dicho procedimiento que comprende: a) el suministro de una colección de microperlas de diferentes subtipos, en las que cada subtipo está recubierto con un antígeno de grupo sanguíneo diferente, incluyendo: A tipo 1 GalNAc1,3(Fuc1,2)Galß1,3GlcNAcß1-R, A tipo 2 GalNAc1,3(Fuc1,2)Galß1,4GlcNAcß1-R, A tipo 3 GalNAc1,3(Fuc1,2)Galß1,3GalNAc1-R, A tipo 4 GalNAc1,3(Fuc1,2)Galß1,3GalNAcß1-R, B tipo 1 Gal1,3(Fuc1,2)Galß1,3GlcNAcß1-R, B tipo 2 Gal1,3(Fuc1,2)Galß1,4GlcNAcß1-R, B tipo 3 Gal1,3(Fuc1,2)Galß1,3GalNAc1-R, y B tipo 4 Gal1,3(Fuc1,2)Galß1,3GalNAcß1-R b) la adición de dicho suero procedente de dicho sujeto a dicha colección de microperlas; c) la incubación de dicho suero y dichas microperlas durante un periodo de tiempo suficiente para que los anticuerpos contra el grupo sanguíneo en dicho suero se unan a dichos antígenos de grupo sanguíneo; d) la incubación de dichas microperlas con al menos un ligando marcado capaz de unirse específicamente a dichos anticuerpos contra el grupo sanguíneo unidos a dichos antígenos de grupo sanguíneo; y e) la detección de la presencia de un ligando marcado unido a dichos anticuerpos contra el grupo sanguíneo para determinar la presencia o ausencia de dichos anticuerpos reactivos. El ligando es, por ejemplo, un anticuerpo o uno de sus fragmentos. El anticuerpo es un fragmento de anticuerpo monovalente tal como un fragmento Fab o Fab. Por ejemplo, el fragmento Fab o Fab es un fragmento de anticuerpo contra Fc, un fragmento de anticuerpo contra la cadena ligera kappa, un fragmento de anticuerpo contra la cadena ligera lambda, y un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla. El marcador es, por ejemplo, un marcador fluorescente. El ligando marcado se detecta mediante procedimientos conocidos en la materia tales como citometría de flujo o luminex. En un aspecto adicional, la invención proporciona un procedimiento para la extracción de anticuerpos reactivos contra los grupos sanguíneos del suero, dicho procedimiento que comprende: a) el suministro de una colección de microperlas de diferentes subtipos, donde cada subtipo está recubierto con un antígeno de grupo sanguíneo diferente, incluyendo: A tipo 1 GalNAc1,3(Fuc1,2)Galß1,3GlcNAcß1-R, A tipo 2 GalNAc1,3(Fuc1,2)Galß1,4GlcNAcß1-R, A tipo 3 GalNAc1,3(Fuc1,2)Galß1,3GalNAc1-R, A tipo 4 GalNAc1,3(Fuc1,2)Galß1,3GalNAcß1-R, B tipo 1 Gal1,3(Fuc1,2)Galß1,3GlcNAcß1-R, B tipo 2 Gal1,3(Fuc1,2)Galß1,4GlcNAcß1-R, B tipo 3 Gal1,3(Fuc1,2)Galß1,3GalNAc1-R, y B tipo 4 Gal1,3(Fuc1,2)Galß1,3GalNAcß1-R b) la puesta en contacto de dicho suero con dicha colección de microperlas; 3   c) la incubación de dicho suero y dichas microperlas durante un periodo de tiempo suficiente para que los anticuerpos contra el grupo sanguíneo en dicho suero se unan a dichos antígenos de grupo sanguíneo; d) la separación de dichas microperlas y dicho suero, extrayendo así dichos anticuerpos reactivos de dicho suero. Opcionalmente, el oligosacárido ABO o las proteínas de fusión ABO están unidos, por ejemplo, covalente o no covalentemente a un soporte sólido tal como microperlas. Las microperlas son de látex, por ejemplo. Por microperlas de un subtipo diferente se quiere decir que las microperlas difieren entre sí en tamaño, color o ambos. El intervalo de diámetros se encuentra entre 2 µm aproximadamente y 15 µm aproximadamente. Preferiblemente, la microperla tiene un diámetro de 5 µm aproximadamente. Más preferiblemente, las microperlas tienen un diámetro de 5 µm aproximadamente. La muestra es de, por ejemplo, sangre entera, suero o plasma. En algunos aspectos, las composiciones se formulan como un absorbente para la extracción de anticuerpos contra el grupo sanguíneo a partir de sangre completa o plasma. La invención también proporciona una colección de microperlas de diferentes subtipos, donde cada subtipo está recubierto con un antígeno de grupo sanguíneo diferente. Por ejemplo, la colección contiene microperlas de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 25, 30, 40, 50 o más subtipos diferentes. A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el utilizado habitualmente por alguien con conocimientos ordinarios en la materia a la que pertenece esta invención. Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, y de las reivindicaciones. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una representación esquemática de los vectores usados para producir las proteínas de fusión que contienen los antígenos de grupo sanguíneo. La Figura 2... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende antígenos de grupo sanguíneo que incluyen: A tipo 1 GalNAc1,3(Fuc1,2)Galß1,3GlcNAcß1-R, A tipo 2 GalNAc1,3(Fuc1,2)Galß1,4GlcNAcß1-R, A tipo 3 GalNAc1,3(Fuc1,2)Galß1,3GalNAc1-R, A tipo 4 GalNAc1,3(Fuc1,2)Galß1,3GalNAcß1-R, B tipo 1 Gal1,3(Fuc1,2)Galß1,3GlcNAcß1-R, B tipo 2 Gal1,3(Fuc1,2)Galß1,4GlcNAcß1-R, B tipo 3 Gal1,3(Fuc1,2)Galß1,3GalNAc1-R, y B tipo 4 Gal1,3(Fuc1,2)Galß1,3GalNAcß1-R en los que R representa un punto adecuado para su unión a un soporte sólido. 2. Un adsorbente que comprende la composición de la reivindicación 1. 3. La composición de la reivindicación 1 o el adsorbente de la reivindicación 2 que comprende adicionalmente un soporte sólido al cual están unidos dichos antígenos de grupo sanguíneo y en la que el soporte sólido es una perla, preferiblemente una microperla. 4. La composición de la reivindicación 1 que comprende adicionalmente una colección de microperlas de subtipos diferentes, donde cada subtipo está recubierto con un antígeno de grupo sanguíneo diferente, incluyendo: A tipo 1 GalNAc1,3(Fuc1,2)Galß1,3GlcNAcß1-R, A tipo 2 GalNAc1,3(Fuc1,2)Galß1,4GlcNAcß1-R, A tipo 3 GalNAc1,3(Fuc1,2)Galß1,3GalNAc1-R, A tipo 4 GalNAc1,3(Fuc1,2)Galß1,3GalNAcß1-R, B tipo 1 Gal1,3(Fuc1,2)Galß1,3GlcNAcß1-R, B tipo 2 Gal1,3(Fuc1,2)Galß1,4GlcNAcß1-R, B tipo 3 Gal1,3(Fuc1,2)Galß1,3GalNAc1-R, y B tipo 4 Gal1,3(Fuc1,2)Galß1,3GalNAcß1-R. 5. Un procedimiento para determinar la presencia de anticuerpos reactivos a los grupos sanguíneos en el suero de un sujeto, dicho procedimiento que comprende: a) el suministro de una colección de microperlas de subtipos diferentes como se define en la reivindicación 4; b) la adición de dicho suero procedente de dicho sujeto a dicha colección de microperlas; c) la incubación de dicho suero y dichas microperlas durante un periodo de tiempo suficiente para que los anticuerpos contra el grupo sanguíneo en dicho suero se unan a dichos antígenos de grupo sanguíneo; d) la incubación de dichas microperlas con al menos un ligando marcado capaz de unirse específicamente a dichos anticuerpos contra el grupo sanguíneo unidos a dichos antígenos de grupo sanguíneo e) la detección de la presencia de ligando marcado unido a dichos anticuerpos contra el grupo sanguíneo para determinar la presencia o ausencia de dichos anticuerpos reactivos. 6. El procedimiento de la reivindicación 5, donde dicha detección se realiza mediante citometría de flujo o luminex. 7. El procedimiento de la reivindicación 5, que comprende adicionalmente la etapa de extracción de dichos 16   componentes del suero que no se unen específicamente a dichos antígenos de grupo sanguíneo presentados sobre dichas microperlas antes de la etapa (d), o que comprende adicionalmente la etapa de extracción de ligando marcado que no se ha unido a dichos anticuerpos contra el grupo sanguíneo antes de la etapa (e). 8. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que dicho ligando es un anticuerpo o uno de sus fragmentos, y, opcionalmente, en el que dicho anticuerpo es un fragmento de anticuerpo monovalente, y opcionalmente de manera adicional donde dicho fragmento de anticuerpo monovalente es un fragmento Fab o Fab. 9. El procedimiento de la reivindicación 8, donde dicho fragmento Fab o Fab se selecciona del grupo constituido por un fragmento de anticuerpo contra Fc, un fragmento de anticuerpo contra la cadena ligera kappa, un fragmento de anticuerpo contra la cadena ligera lambda, y un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla. 10. Un procedimiento para la extracción de los anticuerpos reactivos contra los grupos sanguíneos en suero, dicho procedimiento que comprende: a) el suministro de una colección de microperlas de subtipos diferentes como se define en la reivindicación 4; b) la puesta en contacto de dicho suero con dicha colección de microperlas; c) la incubación de dicho suero y dichas microperlas durante un periodo de tiempo suficiente para que los anticuerpos contra el grupo sanguíneo en dicho suero se unan a dichos antígenos de grupo sanguíneo; d) la separación de dichas microperlas de dicho suero extrayendo así dichos anticuerpos reactivos de dicho suero. 11. La composición de la reivindicación 3 ó 4, o el procedimiento de la reivindicación 5 ó 10, en los que las microperlas son de látex. 12. La composición de la reivindicación 3 ó 4, o el procedimiento de la reivindicación 5 ó 10, en los que las microperlas de al menos uno de los subtipos de antígenos de grupo sanguíneo difieren de las microperlas de al menos otro de los subtipos de grupo sanguíneo seleccionándolas para que tengan diferentes diámetros o diferentes colores. 13. La composición de la reivindicación 3 ó 4, o el procedimiento de la reivindicación 5 ó 10, en los que las microperlas de al menos uno de los subtipos de antígenos de grupo sanguíneo difieren de las microperlas de al menos otro de los subtipos de grupo sanguíneo marcándolas con diferentes marcadores, y opcionalmente en los que los marcadores son marcadores fluorescentes. 14. La composición de la reivindicación 3 ó 4, o el procedimiento de la reivindicación 5 ó 10, en los que las microperlas tienen un diámetro de 5 µm aproximadamente, o en los que las microperlas tienen un diámetro que abarca entre 2 µm y 15 µm y, preferiblemente, entre 4 µm y 10 µm. 17   18   19     21   22   23   24     26   27   28