MÉTODOS Y DISPOSITIVOS DE ENSAYO DE FLUJO LATERAL EN DOS ETAPAS.

Métodos y dispositivos de ensayo de flujo lateral en dos etapas. CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida a métodos y dispositivos de ensayo de flujo lateral en dos etapas, destinados a detectar un primer miembro de un par de unión específico en una muestra. Los métodos y dispositivos resultan particularmente ventajosos para la detección de un primer miembro de un par de unión específico en una muestra que contiene una pluralidad de miembros de pares de unión no específicos. En realizaciones específicas, los métodos y dispositivos son ventajosos a la hora de identificar anticuerpos de IgE específicos en una muestra. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Se conocen en la técnica muchos dispositivos y métodos de ensayo de flujo lateral. Típicamente, los dispositivos y métodos permiten la aplicación de una muestra a una matriz de flujo lateral. La muestra fluye a lo largo de la matriz de flujo lateral, y uno o más componentes de analito que se han de detectar en la muestra reaccionan con al menos un reactivo que se ha proporcionado en la matriz de flujo lateral o se ha añadido a esta. Al menos un reactivo es, típicamente, inmovilizado en el dispositivo para que reaccione con el componente de analito que se ha de detectar o con un reactivo del mismo, y se emplean, típicamente, etiquetas o marcadores para medir la extensión de la reacción con un reactivo inmovilizado. Por ejemplo, la Patente norteamericana Nº 4.981.786, de Dafforn et al., divulga un dispositivo de ensayo para captar un primer miembro de un par de unión específico en una zona, y para permitir que el líquido sea transvasado por capilaridad lejos de la zona. Se añade un reactivo líquido para la realización del ensayo, por ejemplo, que comprende un miembro de par de unión específico, miembros de un sistema de generación de señal, reactivos auxiliares, o similares. Dafforn et al. divulgan el uso específico de su dispositivo y método de ensayo para detectar la presencia de la gonadotropina coriónica humana (HCG human chorionic gonadotrophin). En el documento WO 00/51988 (Heska) se divulga un método para detectar una inmunoglobulina específica de alérgeno, biológicamente activa, utilizando una molécula de receptor épsilon de Fc (FcR). El método es capaz de detectar inmunoglobulinas específicas de alérgeno, biológicamente activas, que no son detectables por un procedimiento que utiliza anticuerpos anti-IgE. La aplicación también divulga equipos para llevar a cabo tales métodos. En el documento US 6.365.417 (A-Fem Medical) se divulga un dispositivo para recoger líquidos orales que incluye una tira de cromatografía de flujo lateral que tiene una tableta de recogida destinada a insertarse en la boca. La tableta de recogida está separada del resto de la tira de cromatografía por medio de una barrera extraíble impermeable al líquido, que evita que el liquido de la tableta de recogida entre en la tira de cromatografía. Una vez que se ha recogido el líquido oral adecuado (según se indica por un indicador o testigo de suficiencia de muestra), el dispositivo se extrae de la boca y la barrera es retirada para permitir que los líquidos orales fluyan a través de la tira. Los líquidos interactúan a través de unas formaciones o configuraciones de unión existentes en la tira, para proporcionar los resultados de la prueba, tales como una indicación de que está presente en el líquido un analito de interés. La tira puede estar contenida en un alojamiento con una abertura de acceso a través de la cual puede ser manipulada la barrera extraíble, así como ventanas a través de las cuales pueden verse los resultados de la prueba. Este dispositivo impide el reflujo de reactivos desde la tira al interior de la boca de un sujeto de prueba durante su uso. En el documento WO 02/056017 se divulga un método y una composición para detectar la presencia de anticuerpos de una clase específica que reaccionan con analitos tales como bacterias, alergenos, antígenos autoinmunes, proteínas virales y carbohidratos, mediante técnicas de flujo lateral. En una realización de la invención, una muestra de prueba o ensayo obtenida de fluidos corporales reacciona con un antígeno marcado con oro. El complejo resultante se desplaza a través de la membrana y a lo largo de la tira de flujo lateral. Unas líneas coloreadas en rojo, formadas en posiciones específicas a lo largo de la tira de ensayo, indican la presencia de anticuerpos de clase específica en el espécimen de prueba. En otra realización de la invención, el ensayo de flujo lateral sirve como prueba de clasificación o resolución inmunocromatográfica para la detección de anticuerpos de IgE específicos de alérgeno en el suero humano. La muestra de ensayo reacciona con un anticuerpo anti-IgE marcado con oro. El complejo resultante se desplaza a través de la membrana, donde unos alergenos inmovilizados capturan el complejo de IgE específico de alérgeno. Se han formado unas líneas coloreadas en las zonas de prueba que indican la presencia de anticuerpos de IgE específicos de alérgeno. En el documento WO 03/048998 se divulga una red sanitaria destinada a compartir información referente a la salud de un usuario con al menos una fuente del exterior, de tal manera que la red incluye un biosensor asociado con el usuario, que genera una señal de biosensor que contiene la información; y unos medios de control de datos personales, que incluyen medios de recepción destinados a recibir la señal de biosensor, medios de entrada para recibir una entrada privada por parte del usuario, y medios de salida destinados a generar una señal de respuesta basándose en la señal de biosensor y en la entrada privada. La red incluye también un módulo de asignación y 2   tratamiento de datos, que incluye medios para recibir la señal de respuesta y medios para generar y dirigir una señal de salida a la al menos una fuente del exterior, de tal manera que el módulo es sensible a la señal de respuesta, y de modo que la disponibilidad de la información para la al menos una fuente del exterior es sensible a la entrada privada. En el documento WO 00/07015 se divulgan dispositivos de ensayo de tira de prueba para la detección de un analito en una muestra de analito fluida en la que el efecto de gancho se minimiza y se evita sustancialmente la interferencia con reacciones de unión en el ensayo, así como métodos para el uso de los dispositivos con esos fines. A tales fines, los dispositivos separan la zona de prueba de la tira de prueba (en la que un agente aglomerante para el analito se une de forma inamovible) y la zona de trazador de la tira de prueba (en la que se une de forma movible un trazador reconstituible) en los planos horizontal y, en algunas realizaciones, vertical. En todas las realizaciones de los dispositivos y métodos de la invención, la muestra de analito fluida aplicada a la tira de prueba entra en contacto con la zona de prueba antes de que el trazador contacte ya sea con la muestra, ya sea con la zona de prueba. El dispositivo resulta especialmente útil para la detección de analito cuya unión con agentes aglomerantes de ensayo sea especialmente sensible a las condiciones de ensayo, tales como un analito de anticuerpo. A fin de facilitar el uso de dispositivos de ensayo de flujo lateral por el personal de laboratorio y por parte de personal médico ajeno a los laboratorios y de los usuarios, por ejemplo, en aplicaciones en centros de salud, y para obtener técnicas de detección más rápidas, ha de ponerse especial atención en la mejora de los dispositivos y métodos de ensayo de una sola etapa. Por ejemplo, las Patentes norteamericanas de May et al. Nos. 5.602.040, 5.622.871, 5.656.503, 6.187.598 y 6.228.660 divulgan dispositivos, equipos y métodos que facilitan métodos de ensayo de flujo lateral en una sola etapa. Se proporciona una tira de prueba con un reactivo marcado y secado que es liberado en una forma móvil por una muestra biológica líquida. El reactivo marcado se une de forma específica con el analito que se ha de detectar, para formar un complejo, y la migración de la muestra líquida a lo largo de la matriz de flujo lateral transporta el complejo por capilaridad hasta una zona de detección. La Patente norteamericana de Hubscher et al. Nº 6.528.325 divulga un dispositivo y un método más específicos para la detección de anticuerpos en el suero humano mediante el uso de un ensayo de flujo lateral que facilita técnicas de una sola etapa. Una muestra de prueba obtenida de fluidos corporales reacciona con un antígeno marcado con oro y el complejo resultante se desplaza a través de una membrana y a lo largo de una tira de flujo lateral. Las líneas de color rojo formadas en posiciones específicas a lo largo de la tira de prueba indican la presencia de anticuerpos de case específica en los especimenes de ensayo. En una realización... [Seguir leyendo]

1.- Un dispositivo de ensayo inmunológico de flujo lateral para identificar anticuerpos de IgE específicos en una muestra, el cual comprende un alojamiento provisto de un acceso o puerta para muestra, un acceso o puerta para solución amortiguadora, situado aguas arriba con respecto a la puerta para muestra, y una ventana de resultado, situada aguas abajo de la puerta para muestra, un pozo para solución amortiguadora, situado aguas arriba de la puerta para muestra y configurado para recibir una cierta cantidad de solución amortiguadora líquida, aplicada a través de la puerta para solución amortiguadora, un camino o recorrido de flujo lateral, situado dentro del alojamiento y que se extiende desde el pozo para solución amortiguadora y al menos hasta la ventana de resultado, y comprende una matriz de flujo lateral, un reactivo marcado y secado, configurado para enlazarse o unirse con un anticuerpo de IgE dispuesto en la matriz de flujo lateral, aguas abajo del pozo para solución amortiguadora y aguas arriba de la puerta para muestra, de tal manera que el reactivo marcado está configurado para ser movilizado dentro de la matriz de flujo lateral por el paso de la solución amortiguadora líquida desde el pozo para solución amortiguadora, a lo largo de la matriz de flujo lateral, y una pluralidad de especies de antígeno para IgE, inmovilizadas en posiciones respectivas en la matriz de flujo lateral, en una primera ubicación visible a través de la ventana de resultado. 2.- El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual la matriz de flujo lateral comprende, en su extremo de aguas arriba, una mecha de aguas arriba que está configurada para el aporte de una solución amortiguadora líquida desde el pozo para solución amortiguadora a la matriz de flujo lateral. 3.- El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 2, en el cual el reactivo marcado se proporciona en la mecha de aguas arriba de la matriz de flujo lateral. 4.- El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 3, en el cual el alojamiento está provisto de una ventana de control situada aguas abajo de la ventana de resultado, y la matriz de flujo lateral comprende, en su extremo de aguas abajo, una mecha de aguas abajo en la que se inmoviliza un anticuerpo de IgE o antirratón no marcado, en una ubicación separada de, y dispuesta aguas abajo con respecto a, la primera ubicación, y visible a través de la ventana de control. 5.- El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 4, en el cual la mecha de aguas abajo incluye marcaciones con pigmento soluble en agua visibles a través de la ventana de control, antes de cualquier adición de líquido al dispositivo. 6.- El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 3, en el cual la matriz de flujo lateral comprende una matriz de nitrocelulosa o una matriz de polímero entre la mecha de aguas arriba y la mecha de aguas abajo. 7.- El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 6, en el cual la matriz de nitrocelulosa se extiende aguas arriba con respecto a la puerta para muestra. 8.- El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual el alojamiento está provisto de una sola puerta para muestra y una sola puerta para solución amortiguadora, de tal manera que el dispositivo comprende dos caminos o recorridos de flujo lateral, dos ventanas de resultado y dos ventanas de control, y de modo que cada recorrido de flujo lateral está asociado con una ventana de resultado respectiva y una ventana de control respectiva. 9.- El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 8, en el cual los recorridos de flujo lateral son sustancialmente paralelos. 10.- El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente un sistema de separación de sangre dispuesto entre la puerta para muestra y la matriz de flujo lateral. 11.- El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 10, en el cual el sistema de separación de sangre comprende al menos una capa de material configurada para agregar o conglomerar células de glóbulos rojos en su seno. 12.- El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 11, en el cual el sistema de separación de sangre comprende al menos una capa de papel de filtro de fibra de vidrio, que incluye manitol como agente aglomerante. 13.- El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 10, en el cual el sistema de separación de sangre incluye una capa inferior que se extiende desde una posición situada bajo la puerta para muestra hasta la matriz de flujo lateral, y que está configurada para proporcionar comunicación de fluido entre el sistema de separación de sangre y la matriz de flujo lateral. 14.- El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual la pluralidad de especies de antígeno para IgE están fijadas a unas partículas inmovilizadas que exhiben grupos hidrófilos en su superficie y tienen un diámetro que es más pequeño que la dimensión interna más pequeña de los canales de flujo de la matriz de flujo lateral en la primera ubicación, de tal manera que las partículas están inmovilizadas en la matriz de flujo lateral, en la primera ubicación. 15.- El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual el alojamiento incluye unos indicadores adyacentes   a la ventana de resultado, que distinguen las posiciones de las respectivas especies de antígeno. 16.- El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual el reactivo marcado comprende anticuerpo anti-IgE marcado con un sol-metal. 17.- El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 16, en el cual el anticuerpo anti-IgE marcado está marcado con un sol-oro. 18.- El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 1, de tal manera que el dispositivo comprende al menos dos recorridos de flujo lateral dentro del alojamiento, cada uno de los cuales se extiende desde el pozo para solución amortiguadora y al menos hasta las ventanas de resultado, y comprende una matriz de flujo lateral, un reactivo marcado y secado, configurado para unirse al anticuerpo de IgE dispuesto en cada matriz de flujo lateral, aguas abajo del pozo para solución amortiguadora y aguas arriba de la puerta para mezcla, de tal modo que el reactivo marcado está configurado para ser movilizado dentro de la matriz de flujo lateral por el paso de una solución amortiguadora líquida desde el pozo para solución amortiguadora, a lo largo de la matriz de flujo lateral, y una pluralidad de especies de antígeno para IgE, inmovilizadas en posiciones respectivas de cada matriz de flujo lateral, en una primera ubicación visible a través de al menos una de las ventanas de resultado. 19.- El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 18, en el cual el alojamiento está provisto de al menos una ventana de control, situada aguas abajo de la ventana de resultado, y el dispositivo comprende, adicionalmente, un anticuerpo de IgE no marcado, inmovilizado en cada matriz de flujo lateral, en una segunda ubicación separada de, y aguas abajo con respecto a, la primera ubicación, y visible a través de al menos una de las ventanas de resultado. 20.- El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 18, en el cual cada matriz de flujo lateral comprende, en su extremo de aguas arriba, una mecha de aguas arriba que está configurada para suministrar una solución amortiguadora líquida desde el pozo para muestra a la matriz de flujo lateral. 21.- El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 20, en el cual el reactivo marcado se ha proporcionado en la mecha de aguas arriba de cada matriz de flujo lateral. 22.- El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 19, en el cual cada matriz de flujo lateral comprende, en su extremo de aguas abajo, una mecha de aguas abajo en la que se encuentra inmovilizado un anticuerpo de IgE o antirratón no marcado. 23.- El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 22, en el cual cada mecha de aguas abajo incluye marcaciones con pigmento soluble en agua, visibles a través de la ventana de control antes de cualquier adición de líquido al dispositivo. 24.- El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 22, en el cual cada matriz de flujo lateral comprende una matriz de nitrocelulosa entre la mecha de aguas arriba y la mecha de aguas abajo, y en el que la primera ubicación en la que está inmovilizada la pluralidad de especies de antígeno, se encuentra en la matriz de nitrocelulosa. 25.- El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 24, en el cual cada matriz de nitrocelulosa se extiende aguas arriba de la puerta para muestra. 26.- El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 18, en el que el alojamiento está provisto de una sola puerta para muestra y una sola puerta para solución amortiguadora, de tal manera que el dispositivo comprende dos recorridos de flujo lateral, dos ventanas de resultado y dos ventanas de control, y en el cual cada recorrido de flujo lateral está asociado con una ventana de resultado respectiva y una ventana de control respectiva. 27.- El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 18, que comprende adicionalmente un sistema de separación de sangre dispuesto entre la puerta para muestra y las matrices de flujo lateral. 28.- El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 27, en el cual el sistema de separación de sangre incluye una capa inferior que se extiende desde una posición por debajo de la puerta para muestra hasta cada matriz de flujo lateral, y está configurado para proporcionar comunicación de fluido entre el sistema de separación de sangre y cada matriz de flujo lateral. 29.- El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 18, en el cual la pluralidad de especies de antígeno están fijadas a unas partículas inmovilizadas que exhiben grupos hidrófilos en su superficie y tienen un diámetro que es más pequeño que la dimensión interna más pequeña de los canales de flujo de las matrices de flujo lateral de la primera ubicación, de tal manera que las partículas están inmovilizadas en las matrices de flujo lateral de la primera ubicación. 30.- El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 18, en el cual el alojamiento incluye unos indicadores adyacentes a la ventana de resultado que distinguen las ubicaciones de las respectivas especies de antígeno. 31.- El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 18, en el cual el reactivo marcado comprende anticuerpo anti-IgE 16   marcado con un sol-metal. 32.- El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 31, en el cual el anticuerpo anti-IgE marcado está marcado con un sol-oro. 33.- Un método de ensayo de flujo lateral en dos etapas para identificar anticuerpos de IgE específicos en una muestra, que comprende aplicar una muestra a un acceso o puerta para muestra, perteneciente a un dispositivo, de tal manera que el dispositivo está configurado para suministrar la muestra a una matriz de flujo lateral que tiene una pluralidad de especies de antígeno para IgE inmovilizadas en posiciones respectivas de una primera ubicación, permitir que la muestra se desplace a lo largo de la matriz de flujo lateral, a través de la pluralidad inmovilizada de especies de antígeno, de tal manera que los anticuerpos de IgE contenidos en la muestra se unen a las especies de antígeno, y hasta una segunda ubicación situada aguas abajo de la primera ubicación, aplicar una solución amortiguadora líquida a la matriz de flujo lateral con el fin de movilizar un reactivo marcado que está configurado para enlazarse o unirse al anticuerpo de IgE y se seca en la matriz de flujo lateral, en una ubicación situada aguas arriba con respecto al suministro de la muestra a la matriz de flujo lateral, y permitir que el reactivo marcado, movilizado por la solución amortiguadora líquida, se desplace a lo largo de la matriz de flujo lateral, a través de la pluralidad inmovilizada de especies de antígeno, donde se une a los anticuerpos de IgE enlazados o unidos. 34.- El método en dos etapas de acuerdo con la reivindicación 33, en el cual la solución amortiguadora líquida se aplica a través de una puerta para solución amortiguadora, situada aguas arriba con respecto al reactivo marcado y secado. 35.- El método en dos etapas de acuerdo con la reivindicación 34, en el cual la solución amortiguadora líquida se suministra desde la puerta para solución amortiguadora a un pozo para solución amortiguadora en comunicación de fluido con la matriz de flujo lateral. 36.- El método en dos etapas de acuerdo con la reivindicación 33, en el cual la muestra es una muestra de sangre entera o completa, y el dispositivo está configurado para filtrar la muestra y suministrar la muestra filtrada, carente de células de glóbulos rojos, a la matriz de flujo lateral. 37.- El método en dos etapas de acuerdo con la reivindicación 36, en el cual la al menos una capa de material incluye manitol como agente aglomerante. 38.- El método en dos etapas de acuerdo con la reivindicación 33, en el cual el desplazamiento de la muestra filtrada a la segunda ubicación se detecta por un cambio visible en la segunda ubicación, y la solución amortiguadora líquida se aplica después de detectarse el cambio visible. 39.- El método en dos etapas de acuerdo con la reivindicación 33, en el cual el reactivo marcado, movilizado por la solución amortiguadora líquida, se desplaza hasta la segunda ubicación. 40.- El método en dos etapas de acuerdo con la reivindicación 39, en el cual el desplazamiento del reactivo marcado hasta la segunda ubicación es detectado por un cambio visible en la segunda ubicación. 41.- El método en dos etapas de acuerdo con la reivindicación 33, en el cual el reactivo marcado comprende un anticuerpo de IgE. 42.- El método en dos etapas de acuerdo con la reivindicación 33, en el cual la muestra es sangre entera o completa. 43.- El método de acuerdo con la reivindicación 34, en el que la muestra es sangre y en el cual la solución amortiguadora líquida se aplica a la puerta para solución amortiguadora una vez transcurrido un periodo de tiempo predeterminado. 44.- El método de acuerdo con la reivindicación 43, en el cual el dispositivo es el dispositivo de acuerdo con la reivindicación 18. 45.- Un equipo para identificar anticuerpos de IgE específicos en una muestra, que comprende un capilar para recoger una cierta cantidad de sangre entera o completa, y el dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32, en el cual el dispositivo está configurado para recibir la cantidad de sangre entera desde el capilar. 46.- El equipo de acuerdo con la reivindicación 45, que comprende adicionalmente una solución amortiguadora líquida en una cantidad suficiente para movilizar el anticuerpo marcado y transportar el anticuerpo marcado a lo largo de la matriz de flujo lateral, hasta la segunda ubicación. 17   18   19