CITOCROMO C Y SU GEN.

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNA SECUENCIA DE DNA QUE COMPRENDE UNA SECUENCIA DE DNA QUE CODIFICA,

CUANDO SE EXPRESA EN UNA CELULA HUESPED PROCARIOTA O EUCARIOTA, POLIPEPTIDOS QUE TIENEN POR LO MENOS UNA PARTE DE LA ESTRUCTURA PRIMARIA Y UNA DE LAS PROPIEDADES BIOLOGICAS DEL CITOCROMO C551, UN POLIPEPTIDO CODIFICADO POR DICHA SECUENCIA DE DNA, UN VECTOR DE EXPRESION QUE COMPRENDE DICHA SECUENCIA DE DNA, UNA CELULA HUESPED TRANSFORMADA MEDIANTE DICHO VECTOR, UN PROCESO PARA LA PRODUCCION UTILIZANDO DICHA CELULA HUESPED Y LA UTILIZACION DE DICHO CITOCROMO C PARA LA PRODUCCION DE VITAMINA C

Se sabe que el citocromo c es uno de los componentes esenciales que media la transferencia de electrones entre las deshidrogenasas primarias y la oxidasa terminal para lograr la oxidación del sustrato con reducción de oxígeno molecular a H2O. Esta reacción de transferencia electrónica se basa en una oxidación-reducción del hierro hemo. Recientemente se han hecho intentos para aplicar la reacción de transferencia electrónica de citocromo c como nuevos materiales que imitan materiales o elementos biológicos, a saber, biochips, por ejemplo usando citocromo c552 de Hydrogenobacter thermophilus (Kodama et al., patente U.S. nº 5459046). Las bacterias del ácido acético, incluyendo Gluconobacter y Acetobacter, poseen una capacidad altamente eficiente de oxidar azúcares y alcoholes de azúcares, y se usan industrialmente para producir vinagre y L-sorbosa, que se usa como intermedio para la producción de vitamina C. Para la fermentación oxidativa, el citocromo c desempeña un papel importante para completar la oxidación. Las proteínas del citocromo c se purificaron y caracterizaron para muchos organismos, incluyendo Gluconobacter; por ejemplo, Matsushita et al. dieron a conocer la purificación del citocromo c553 de unión a CO (CO) (peso molecular 48 kDa) a partir de Gluconobacter suboxydans (FEMS Microbiol. Lett., 10:267-270, 1981), y más tarde se encontró que el citocromo c553 (CO) era idéntico a la segunda subunidad de alcohol deshidrogenasa de Gluconobacter. La amplificación del citocromo c553 (CO) en una Gluconobacter deficiente en la segunda subunidad de alcohol deshidrogenasa mejoró ligeramente la producción de L-sorbosa a partir de D-sorbitol en su velocidad específica (gramo de producto por gramo de célula hora), como se describe en J. Ferment. Bioeng., 74, 209-213, 1992 (Y. Takeda et al.). Además del citocromo c553, el citocromo c551(AL) (peso molecular 55 kDa) y el citocromo c551 (CO) (peso molecular 72 kDa) [Ameyama et al., Agri. Biol. Chem. 51, 2943-2950 (1987)] también se aislaron a partir de Gluconobacter.

Es un objeto de la presente invención proporcionar un nuevo citocromo c que pertenece a una familia de proteínas que tiene funciones como aceptor de electrones. Más particularmente, el nuevo citocromo c de la presente invención es útil como un aceptor de electrones de deshidrogenasa, tal como alcohol y aldehído deshidrogenasa.

La presente invención también se refiere a derivados funcionales de los polipéptidos del presente caso. Tales derivados funcionales se definen en base a las secuencias de aminoácidos de la presente invención mediante adición, inserción, supresión y/o sustitución de uno o más restos de aminoácidos de tales secuencias, en los que tales derivados todavía tienen actividad de citocromo c medida mediante un ensayo conocido en la técnica o descrito específicamente aquí. Tales derivados funcionales se pueden obtener mediante síntesis química de péptidos, conocida en la técnica, o por medios recombinantes, basándose en las secuencias de ADN como se describen aquí mediante métodos conocidos en el estado de la técnica y descritos, por ejemplo, por Sambrook et al. (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, segunda edición 1989). Los intercambios de aminoácidos en proteínas y péptidos que no alteran generalmente la actividad de tales moléculas son conocidos en el estado de la técnica, y se describen, por ejemplo, por H. Neurath y R.L. Hill en “The Proteins” (Academic Press, Nueva York, 1979, véase especialmente la Figura 6, página 14). Los intercambios que se producen de forma más habitual son: Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly, así como estos en contrario.

Además, la presente invención se refiere a secuencias de ADN que comprenden una secuencia de ADN que codifica, con la expresión en una célula hospedante procariota o eucariota, polipéptidos que tienen al menos una parte de la estructura primaria y una de las propiedades biológicas del citocromo c551, como se describe, por ejemplo, en el listado de secuencias, así como sus hebras complementarias, o aquellas que incluyen estas secuencias, secuencias de ADN que se hibridan, preferiblemente en condiciones estándar, con tales secuencias o sus fragmentos, y secuencias de ADN que, debido a la degeneración del código genético, no se hibridan en condiciones estándar con tales secuencias pero que codifican polipéptidos que tienen exactamente la misma secuencia de aminoácidos.

“Condiciones estándar” para la hibridación significa, en este contexto, las condiciones que se usan generalmente por la persona experta en la técnica para detectar señales de hibridación específicas, y que se describen, por ejemplo, por Sambrook et al., “Molecular Cloning”, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, Nueva York, o preferiblemente las denominadas condiciones de hibridación restrictivas y condiciones de lavado no restrictivas, o más preferiblemente las denominadas condiciones moderadamente restrictivas, o incluso más preferiblemente las denominadas condiciones de hibridación restrictivas y de lavado restrictivas con las que está familiarizada una persona experta en la técnica y que se describen, por ejemplo, en Sambrook et al. (s.a.).

Además, es un objeto de la presente invención proporcionar una secuencia de ADN como se especifica anteriormente, que comprende además una secuencia de ADN que codifica un polipéptido que tiene actividad de alcohol/aldehído deshidrogenasa. Tales constructos se pueden preparar, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 6.

Además, es un objeto de la presente invención proporcionar un polipéptido que contiene actividad de citocromo c y que es codificado por una secuencia de ADN definida anteriormente, o un polipéptido que tiene actividad de citocromo c obtenible u obtenido a partir de un microorganismo que pertenece al género Gluconobacter seleccionado del grupo que consiste en los citocromos c551 I y II, que muestran respectivamente las siguientes propiedades fisicoquímicas:

(a) citocromo c551 I:

(a) peso molecular: alrededor de 19 ± 1 kDa mediante filtración en gel, y alrededor de 18 ± 1,0 kDa mediante análisis de SDS-PAGE;

(b) espectro de absorción: la forma reducida muestra máximos de absorción a 551 nm, 522 nm y 417 nm como picos alfa, beta y gamma, respectivamente;

(c) contenido hemo: alrededor de 1 mol de hemo/mol de proteína;

(d) punto isoeléctrico: alrededor de 3,95;

y

(b) citocromo c551 II:

(a) peso molecular: alrededor de 19 ± 1 kDa mediante filtración en gel, y alrededor de 16,8 ± 1,0 kDa mediante análisis de SDS-PAGE;

(b) espectro de absorción: la forma reducida muestra máximos de absorción a 551 nm, 522 nm y 417 nm como picos alfa, beta y gamma, respectivamente;

(c) contenido hemo: alrededor de 1 mol de hemo/mol de proteína;

(d) punto isoeléctrico: alrededor de 3,75.

Además, es un objeto de la presente invención proporcionar una secuencia de ADN como se especifica anteriormente que comprende además una secuencia de ADN que codifica un polipéptido que tiene actividad de alcohol/aldehído deshidrogenasa.

Además, es un objeto de la presente invención proporcionar un vector adecuado para la expresión en una célula hospedante procariota o eucariota que comprende una secuencia de ADN como se define anteriormente, y una célula hospedante que se ha transformado mediante tal vector, más específicamente tal célula hospedante en la que se ha integrado en su genoma una secuencia de ADN como se define anteriormente; adicionalmente, tales células hospedantes que tienen origen eucariota, y preferiblemente una célula de mamífero o vegetal, o tales células hospedantes que tienen origen procariota, especialmente cuando se seleccionan del grupo que consiste en bacterias, tales como Escherichia coli, Pseudomonas putida, Acetobacter xylinum, Acetobacter pasteurianus, Acetobacter aceti, Acetobacter hansenii, y Gluconobacter oxydans, por ejemplo Gluconobacter oxydans DSM No. 4025.

Además, es un objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para producir citocromo c551, que comprende cultivar una célula hospedante como se define anteriormente en un medio de cultivo apropiado, y recuperar del cultivo el citocromo c551.

El citocromo c de la presente invención también es aplicable para mejorar la producción de 2KGA a partir de Lsorbosa o D-sorbitol, y además la producción de aldehídos, ácidos carboxílicos y cetonas... [Seguir leyendo]

1. Una secuencia de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica, con la expresión en una célula hospedante procariota o eucariota, un polipéptido que tiene actividad de citocromo c, seleccionándose dicha secuencia de ADN entre:

(a) la secuencia de ADN identificada mediante SEC ID NO: 1 o la hebra complementaria de la misma;

(b) secuencias de ADN que tienen actividad de citocromo c que se hibridan a las secuencias de ADN definidas en (a) en condiciones estándar, que se usan para detectar señales de hibridación específicas, y

(c) secuencias de ADN que, salvo por la degeneración del código genético, se hibridarían a las secuencias de ADN definidas en (a) o (b) que tienen actividad de citocromo c, y cuyas secuencias codifican un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos.

2. Una secuencia de ADN como se especifica en la reivindicación 1, que comprende además una secuencia de ADN que codifica un polipéptido que tiene actividad de alcohol/aldehído deshidrogenasa.

3. Un polipéptido que tiene actividad de citocromo c y que es codificado por una secuencia de ADN según se reivindica en la reivindicación 1 ó 2.

4. Un polipéptido según la reivindicación 3, que tiene actividad de citocromo c obtenible u obtenido a partir de un microorganismo que pertenece al género Gluconobacter seleccionado del grupo que consiste en citocromos c551 I y II que muestran respectivamente las siguientes propiedades fisicoquímicas:

(a) peso molecular de 18,0 ± 1 kDa para c551 I y 16,8 ± 1,0 kDa para c551 II según se determina mediante análisis de SDS-PAGE;

(b) máximos de absorción de la forma reducida a 551 nm, 522 nm y 417 nm como picos alfa, beta y gamma, respectivamente;

(c) contenido hemo de 1 mol de hemo/mol de proteína;

(d) punto isoeléctrico de alrededor de 3,95 para c551 I y 3,75 para c551 II.

5. Un vector adecuado para la expresión en una célula hospedante procariota o eucariota, que comprende la secuencia de ADN según se reivindica en la reivindicación 1 ó 2.

6. Una célula hospedante que comprende el vector según la reivindicación 5.

7. Una célula hospedante según se reivindica en la reivindicación 6, célula hospedante en la que se ha integrado en su genoma la secuencia de ADN según se reivindica en la reivindicación 1 ó 2.

8. Una célula hospedante según se reivindica en la reivindicación 6 ó 7, que es de origen eucariota, y preferiblemente una célula de mamífero o vegetal.

9. Una célula hospedante según se reivindica en la reivindicación 6 ó 7, que es de origen procariota.

10. Una célula hospedante según la reivindicación 9, seleccionada del grupo que consiste en Escherichia coli, Pseudomonas putida, Acetobacter xylinum, Acetobacter pasteurianus, Acetobacter aceti, Acetobacter hansenii, y Gluconobacter oxydans.

11. Una célula hospedante según se reivindica en la reivindicación 10, que es Gluconobacter oxydans DSM No. 4025.

12. Un procedimiento para producir citocromo c551, que comprende cultivar una célula hospedante como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11 en un medio de cultivo apropiado, y recuperar el cultivo del citocromo c551.

13. Uso del citocromo c551 como se reivindica en la reivindicación 1, para la producción de vitamina C.