PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCIÓN DE LISADOS DE CÉLULAS TUMORALES INDUCIDAS POR TEMPERATURA PARA USAR COMO COMPUESTOS INMUNÓGENOS.

Un lisado que se puede obtener por un procedimiento que comprende las etapas de (a) inducir necrosis en células NM-F9 (depósito DSMZ nº DSM Acc2606) o en células NM-D4 (depósito DSMZ nº DSM Acc2605) a una temperatura de más de 41,

2ºC durante al menos 15 minutos; y (b) lisar dichas células necróticas para así obtener un lisado, en el que el lisado que se puede obtener por dicho procedimiento es capaz de inducir una respuesta inmunitaria humoral contra el antígeno TF

La presente invención se refiere a un lisado que se puede obtener por un procedimiento para la producción de un compuesto inmunógeno, que comprende inducir necrosis mediante temperatura en células 5 tumorales y lisar dichas células tumorales necróticas para así obtener el lisado. Además, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el lisado que se puede obtener por el procedimiento mencionado. Además, se proporcionan usos del lisado para la vacunación contra cánceres o células dendríticas cargadas con el lisado celular.

La vacunación implica la administración de un agente a un individuo, que estimulará el sistema 10 inmunitario para que reaccione contra los componentes “extraños” de la vacuna. La vacuna se puede administrar, entre otros, en la piel, músculo, por vía intraoral, subcutánea, intradérmica, intranodal, intraperitoneal, intra o peritumoral o intravenosa. Los componentes extraños de la vacuna se conocen como “antígenos”. Como resultado de un procedimiento de vacunación, un individuo desarrolla inmunidad de modo que una exposición posterior al o a los antígenos producirá una respuesta para eliminar o destruir las 15 células, organismos o partículas que llevan el antígeno, o mejorar los síntomas de la enfermedad, o proteger frente a una enfermedad relacionada. Las vacunas han sido muy eficaces para proteger a la gente frente a organismos infecciosos. Las vacunaciones para los agentes infecciosos bacterianos o víricos ahora se usan de forma rutinaria para: virus influenza, sarampión, varicela, polio, bacterias neumocócicas, y virus de la hepatitis y similares. 20

Debido al éxito en la inmunización de individuos frente a determinados organismos infecciosos, ha sido una tarea importante para los médicos y científicos desarrollar vacunas eficaces contra los cánceres.

La lucha contra las enfermedades infecciosas con las vacunas también enseña que la prevención de enfermedades infecciosas con vacunas es más fácil que la terapia de la misma enfermedad en desarrollo. Se ha interpretado que esta experiencia sugiere que la vacunación profiláctica contra el cáncer 25 puede ser más eficaz que la vacunación cuando la enfermedad está en un estado avanzado. Por lo tanto, hay varios tipos de vacunas para el cáncer o terapias inmunitarias en desarrollo y se dirigen a su uso para prevenir, mejorar y/o tratar el cáncer y/o enfermedades tumorales. En principio la hipótesis anterior era la siguiente: las células tumorales se pueden debilitar o atenuar, e inyectar como una vacuna en un mamífero, por ejemplo un ratón. Después, si se inyectan estas mismas células tumorales, con toda su fuerza, en el 30 ratón, el ratón rechazará o luchará contra las células tumorales y no se desarrollará el cáncer o disminuirá la carga tumoral. Sin embargo, si un ratón no se ha vacunado desarrollará cáncer.

Las inmunoterapias para prevenir, mejorar y/o tratar el cáncer y las enfermedades tumorales mediante el uso de vacunas de células enteras (WCV) tienen la ventaja de ser multivalentes con respecto a los antígenos tumorales, sin embargo las WCV a menudo son solo débilmente inmunógenas. En 35 general, hay que distinguir entre vacunas que comprenden células tumorales enteras vitales (WCV) y vacunas que comprenden células tumorales lisadas (TCLV) (Sivanandham (2000), Biological Therapy of cancer, Ed. Rosenberg, S.A., 632-647).

Las vacunas de células enteras (WCV) tienen la ventaja de que las células tumorales se pueden manipular genéticamente antes de la vacunación, y por lo tanto, usar como un vehículo para sustancias 40 que tienen un efecto inmunoestimulador (Mach (2000), Curr. Opin. Immunol. 12, 571-575). Sin embargo, las desventajas de esta terapia son el alto coste experimental de la manipulación genética de dichas células, los problemas de mantener un estándar de calidad alto en la producción de las vacunas de células enteras y los problemas éticos que acompañan a la administración de las células tumorales vitales como vacunas (Sivanandham (2000), citado antes). 45

Con respecto a las WCV, varias publicaciones mostraron que el tipo de muerte celular influye en la respuesta inmunitaria (Melcher (1999), J. Mol. Med. 77, 824-833). Además, se encontró que la expresión de proteínas de choque térmico influye en la respuesta inmunitaria contra las células (Galucci (2001), Curr. Opin. Immunol. 13, 114-119; Todryk (2000), Immunology 163,1398-1408). Además, existe un gran número de procedimientos para inducir la muerte celular, en particular la apoptosis, que influyen 50 mucho en la inmunogenicidad de las células tumorales apoptóticas (Restifo (2000), Curr. Opin. Immunol. 12, 597-603). Con respecto a las WCV, diferentes publicaciones mostraron que las células tumorales necróticas vitales tanto in vitro como in vivo, es decir, en el sistema de modelo animal, son más inmunógenas que células apoptóticas o no tratadas. En esas publicaciones la muerte celular se inducía químicamente mediante ganciclovir en las células tumorales, las cuales expresan la timidina cinasa del 55 virus del herpes simplex (HSV)(HSVtk). Dicha timidina cinasa del HSV funciona como un llamado “gen suicida” si es inducido, por ejemplo, con ganciclovir. Sin embargo, la muerte celular solo se produce después de aplicar ganciclovir si las células que llevan el gen de timidina cinasa de HSV recombinante, albergan además el gen antiapoptótico bcl-2. Por el contrario, las células positivas para la timidina cinasa de HSV y negativas para bcl-2, experimentan la muerte celular programada después de inducción de la 60 timidina cinasa de HSV por ganciclovir. Solo el uso de células tumorales enteras positivas para HSVtk y bcl-2 para la vacunación profiláctica de ratones y la posterior administración de ganciclovir, dieron como resultado una protección de los animales contra el desarrollo de tumores (Gough (2001), Cancer Res. 61, 7240-7247; Melcher (1998), Nat. Med. 4, 581-587). También se observó que los macrófagos fagocitaban tanto células tumorales necróticas como apoptóticas, sin embargo, reaccionaban de forma diferente con 5 respecto a dichas células tumorales. Por un lado, las citocinas inmunoestimuladoras, tales como TNFα o IL-1β, eran secretadas si los macrófagos fagocitaban las células necróticas, por otra parte las citocinas inmunosupresoras, como IL-10, eran secretadas si eran fagocitadas las células apoptóticas (Gough (2001), citado antes). Además, se ensayó el patrón de secreción de macrófagos que se cultivaban simultáneamente con células tumorales incubadas durante 1 hora a 45ºC o con células tumorales 10 incubadas durante 15 minutos a 45ºC. Si se estimulaban con células tumorales, que eran inducidas térmicamente durante 1 hora, los macrófagos reaccionaban de forma similar a los estimulados con células necróticas inducidas químicamente, con respecto a la secreción de citocinas. Mientas que las células tumorales que eran inducidas térmicamente durante 15 minutos parecían células apoptóticas en que producían la secreción de citocinas inmunosupresoras después de ser fagocitadas por macrófagos 15 (Gough (2001), citado antes). Somersan (2001), J. Immunol. 167, 4844-4852, describe que los lisados de tejidos tumorales primarios están enriquecidos en proteínas de choque térmico e inducen la maduración de células dendríticas humanas.

A diferencia de los descubrimientos mencionados, se encontró que las células tumorales apoptóticas vivas son tan inmunógenas como las células tumorales necróticas o incluso más 20 inmunógenas (Kotera (2001), Cancer Res. 61, 8105-8109; Restifo (2000), citado antes; Shaif-Muthana (2000), Cancer Res. 60, 6441-6447); Albert (1998), Nature 392, 86-89). En estas publicaciones se llevaron a cabo otros procedimientos distintos de los usados en la publicación mencionada antes para la inducción de la muerte celular. Por ejemplo, Kotera (2001) (citado antes) no pudo encontrar diferencias entre las células presuntamente necróticas, que se generaban por congelación y descongelación, y las 25 células apoptóticas que se generaban por tratamiento con UV-B, cuando se analizaba la activación de células dendríticas. Se observó lo mismo en un sistema modelo animal cuando se investigaba la eficacia profiláctica y terapéutica de las células dendríticas que habían absorbido las células supuestamente necróticas o apoptóticas. Shaif-Muthana (2000) (citado antes) comparó la inmunogenicidad de células apoptóticas irradiadas con radiactividad con células supuestamente necróticas incubadas durante 30 30 minutos a 50ºC. Se mostró que solo las células apoptóticas podían activar linfocitos...

40

1. Un lisado que se puede obtener por un procedimiento que comprende las etapas de

(a) inducir necrosis en células NM-F9 (depósito DSMZ nº DSM Acc2606) o en células NM-D4 (depósito DSMZ nº DSM Acc2605) a una temperatura de más de 41,2ºC durante al menos 15 minutos; y

(b) lisar dichas células necróticas para así obtener un lisado, 5

en el que el lisado que se puede obtener por dicho procedimiento es capaz de inducir una respuesta inmunitaria humoral contra el antígeno TF.

2. El lisado de la reivindicación 1, en el que dicha inducción de necrosis se logra por incubación de dichas células a una temperatura de más de 42ºC.

3. El lisado de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha inducción de necrosis se logra por incubación 10 de dichas células a una temperatura de más de 45ºC a 55ºC.

4. El lisado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha inducción de necrosis se logra por incubación de dichas células a una temperatura en el intervalo de 45,5ºC a 47ºC.

5. El lisado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha inducción de necrosis se lleva a cabo en el intervalo de 2 a 3 horas. 15

6. Células dendríticas cargadas con el lisado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Una composición que comprende un lisado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o las células dendríticas de la reivindicación 6.

8. La composición de la reivindicación 7, que es una composición farmacéutica.

9. La composición de la reivindicación 7, que es una composición de vacuna. 20

10. La composición farmacéutica de la reivindicación 8 o la composición de vacuna de la reivindicación 9, que se combina opcionalmente con un adyuvante.

11. Las células dendríticas de la reivindicación 6 o la composición de la reivindicación 7, en las que dichas células dendríticas son inmaduras.

12. Las células dendríticas de la reivindicación 6 o la composición de la reivindicación 7, en las que 25 dichas células dendríticas son maduras.

13. Un procedimiento para producir una composición de vacuna que comprende la etapa de combinar un lisado celular de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o las células dendríticas de la reivindicación 6, con un adyuvante.

14. Un procedimiento para producir una composición farmacéutica que comprende la etapa de 30 combinar un lisado celular de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

15. Uso del lisado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o de las células dendríticas de la reivindicación 6, para preparar una composición farmacéutica o de vacuna para el tratamiento o prevención de cánceres o enfermedades tumorales. 35

16. El uso de la reivindicación 15, en el que dicho cáncer o enfermedad tumoral es un cáncer de cabeza y cuello, pulmón, mediastino, tracto gastrointestinal, sistema genitourinario, sistema ginecológico, mama, sistema endocrino, piel, en la infancia, cáncer metastásico o de sitio primario desconocido, un sarcoma del tejido blando y hueso, un mesotelioma, un melanoma, un neoplasma del sistema nervioso central, un linfoma, una leucemia, un síndrome paraneoplásico, una carcinomatosis peritoneal, un tumor 40 maligno relacionado con inmunosupresión y/o cáncer metastásica.

17. El lisado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o de las células dendríticas de la reivindicación 6, para usar en el tratamiento o prevención de cánceres o enfermedades tumorales.

18. El lisado o células dendríticas para usar según la reivindicación 17, en el que dicho cáncer o enfermedad tumoral es un cáncer de cabeza y cuello, pulmón, mediastino, tracto gastrointestinal, sistema 45 genitourinario, sistema ginecológico, mama, sistema endocrino, piel, en la infancia, cáncer metastásico o de sitio primario desconocido, un sarcoma del tejido blando y hueso, un mesotelioma, un melanoma, un neoplasma del sistema nervioso central, un linfoma, una leucemia, un síndrome paraneoplásico, una carcinomatosis peritoneal, un tumor maligno relacionado con inmunosupresión y/o cáncer metastásico.

50