USO DE VEGF MUTADO PARA LA TERAPIA ANTIANGIOGENICA.

Aplicacion de secuencias oligonucleotídicas y polipeptídicas de moléculas pertenecientes a la familia del factor de permeabilidad vascular (VPF),

sus receptores y correceptores; así como modificaciones de los mismos, en la inmunoterapia activa de entidades patológicas cuyo curso se asocia al aumento de la vasculatura.Estos procedimientos pueden ser empleados en la terapia única o combinada para el tratamiento del cáncer y sus metástasis, los procesos inflamatorios agudos y crónicos, enfermedades infecciosas, enfermedades autoinmunes, la retinopatía diabética y del recién nacido, el rechazo al transplante de órganos, la degeneración macular, los glaucomas neovasculares, hemangiomas y los angiofibromas, entre otros

La presente invención se refiere al campo de la biotecnología y de la industria farmacéutica, en particular a una inmunización activa que emplea como diana moléculas relacionadas con la angiogénesis.

El proceso de formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos preexistentes se denomina angiogénesis. Este acontecimiento está extensamente regulado mediante el equilibrio entre factores proangiogénicos y antiangiogénicos. Entre las enfermedades cuyo desarrollo se ha relacionado con la inducción de factores proangiogénicos y la formación de nuevos vasos sanguíneos de forma anómala están: (a) el cáncer (tumores primarios y sus metástasis); (b) procesos inflamatorios agudos y crónicos, tales como asma, insuficiencia respiratoria, endometriosis, aterosclerosis, y edema tisular; (c) enfermedades de origen infeccioso, tales como hepatitis y sarcoma de Kaposi; (d) enfermedades autoinmunológicas, tales como diabetes, psoriasis, artritis reumatoide, tiroiditis; y (e) otras enfermedades y estados, tales como retinopatías diabética y del recién nacido, rechazo al transplante de órganos, degeneración macular, glaucoma neovascular, hemangioma, y angiofibroma (Carmelliet P. y Jain R.K., Nature, 407:249, 2000; Kuwano M. et al., Intern. Med., 40:565, 2001). Un procedimiento terapéutico potencialmente atractivo para muchos de estos casos podría basarse en la inhibición de la actividad de los factores proangiogénicos, que estimulan la formación anómala de vasos sanguíneos, a través de su neutralización o de la neutralización de sus receptores, o eliminando las fuentes que los producen.

Los factores del crecimiento del endotelio vascular son una familia de moléculas que inducen la formación de nuevos vasos de manera específica y directa (Leung, Science, 246:1306, 1989; Kiagsbum M., Annual Rev. Physiol., 33:217, 1991). Esta familia incluye el factor de permeabilidad vascular, también conocido como factor del crecimiento del endotelio vascular VPF/VEGF (ahora denominado VEGF-A), el factor del crecimiento de la placenta PIGF, los factores del crecimiento derivados de plaquetas PDGF-A y PDGF-B, y otras cuatro moléculas nuevas relacionadas desde el punto de vista estructural y funcional con el VEGF-A, denominadas VEGF-BNRF, VEGF-C/VRP, VEGDD/FIGF y VEGF-E (Olofsson B. et al., PNAS USA, 13:2576, 1996; Joukov V. et al., EMBO J., 15:290, 1996; Yamada

Y. et al., Genomics, 42:483, 1997; Ogawa S. et al., J. Biol. Chem., 273:31273, 1998).

El VEGF-A es una glicoproteína homodimérica formada por dos subunidades de 23 kDa (Ferrara N. et al., Biochem. Biophys. Res. Comun., 165:198, 1989), de las cuales existen cinco isoformas monoméricas, derivadas del corte y empalme diferencial del mismo ARN. Estas incluyen dos isoformas que permanecen unidas a la membrana celular (VEGF 189 y VEGF 206), y tres de naturaleza soluble (VEGF 121, VEGF 145 y VEGF 165). La VEGF 165 es la isoforma más abundante en tejidos de mamífero, excepto el pulmón y el corazón en que predomina la VEGF 189 (Neufeld G. et al., Canc. Met. Rev., 15:153, 1995), y en la placenta, en la que predomina la expresión de VEGF 121 (Shibuya M.A. et al., Adv. Canc. Res., 67:281, 1995).

El VEGF-A es la proteína mejor estudiada y caracterizada de esta familia, y su alteración se ha descrito en un gran número de enfermedades. Su sobreexpresión está asociada a tumores de diferente origen y localización y sus metástasis (Grunstein J. et al., Cancer Res., 59:1592, 1999), a procesos inflamatorios crónicos, tales como colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn (Kanazawa S. et al., Am. J. Gastroenterol., 96:822, 2001), a la psoriasis (Detmar M., et al., J. Exp. Med., 180:1141, 1994), a la insuficiencia respiratoria (Thickett D.R. et al., Am. Respir. Crit. Care Med., 164:1601, 2001), a la aterosclerosis (Celletti F.L. et al., Nat. Med., 7:425, 2001; Couffinhal T. et al., Am. J. Pathol., 150:1653, 1997), a la endometriosis (McLaren J., Hum. Reprod. Update, 6:45, 200), al asma (Hoshino M. et al., J. Allergy Clin. Immunol., 107:295, 2001), a la artritis reumatoide y a la osteoartritis (Pufe T. et al., J. Rheumatol., 28:1482, 2001), a la tiroiditis (Nagura S. et al., Hum. Pathol. 32:10, 2001), a las retinopatías diabética y del recién nacido (Murata T. et al., Lab. Invest., 74:819, 1996; Reynolds J.D., Paediatr. Drugs, 3:263, 2001), a la degeneración macular y al glaucoma (Wells J.A. et al., Br. J. Ophthalmol., 80:363, 1996; Tripathi R.C. et al., Ophthalmology, 105:232, 1998), al edema tisular (Kaner R.J. et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 22:640 2000; Ferrara N., Endocrinol Rev., 13:18, 1992), a la obesidad (Tonallo C. et al., FEBS Lett., 442:167, 1999), a los hemangiomas (Wizigmann S. y Plate K.H., Histol. Histopathol., 11:1049, 1996), en el fluido sinovial de pacientes con artropatías inflamatorias (Bottomley M.J. et al., Clin. Exp. Immunol., 119:182, 2000), y asociada al rechazo de transplantes (Vasir B. et al., Transplantation, 71:924, 2001). En el caso concreto de los tumores, las células que expresan las tres isoformas básicas de VEGF-A: 121, 165, y 189, son las que crecen con mayor rapidez in vivo; mientras que en las etapas finales, la mayoría de los tumores limitan la expresión a la isoforma VEGF 165 o, en su ausencia, a una combinación de 121 y 189 que, lejos de ser aditiva, evidencia una cooperación que refuerza la red vascular tumoral (Grunstein J., Mol. Cell. Biol., 20:7282, 2000).

El PIGF, descrirto en 1991, no es capaz de inducir la proliferación endotelial en su forma homodimérica (Maglione D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9267, 1991; DiSalvo J. et al., J. Biol. Chem., 270:7717, 1995). Con la sobrerregulación de PIGF, y con ella, de la señal transducida a través de VEGFR-1, las células endoteliales amplifican sus respuestas al VEGF durante el cambio al fenotipo angiogénico asociado a ciertas patologías (Carmeliet P. et al., Nat. Med., 7:575, 2001). La expresión de PIGF se ha relacionado con la vascularización del meningioma y glioma humanos (Nomura M. et al., J. Neurooncol., 40:123, 1998). Esta molécula forma heterodímeros con VEGF 165, con actividad proangiogénica, y se ha descrito su sobreexpresión en el medio acondicionado de algunas líneas de células tumorales (Cao Y. et al., J. Biol. Chem., 271:3154,1996), y está asociada a la evolución de la artritis reumatoide y a artropatías inflamatorias primarias, en general (Bottomley M.J. et al., Clin. Exp. Immunol., 119:182, 2000).

**(Ver fórmula)**

La sobreexpresión del resto de los miembros de la familia VEGF, menos estudiados, también está asociada con una serie de patologías. El VEGF-B se ha relacionado con tumores de mama, de ovario y de riñón, y a melanomas y fibrosarcomas (Sowter H.M. et al., Lab. Invest.. 77:607, 1997; Salven P., Am. J. Pathol., 153:103, 1998; Gunningham

S.P. et al., Cancer Res., 61:3206, 2001). Se ha divulgado la expresión diferencial de la isoforma VEGF-B 167 in vitro en células tumorales de diverso origen (Li X. et al., Growth Factors. 19:49, 2001). El VEGF-C y el VEGF-D están implicados en la regulación de la formación de vasos linfáticos (Joukov V. et al., EMBO J., 15: 290, 1996), y la sobreexpresión de VEGF-C está asociada con edemas tisulares, con tumores de mama, de pulmón, de cabeza y cuello, de esófago y de estómago, linfomas, cáncer de próstata, y nódulos metastásicos (Kajita T. et al., Br. J. Cancer., 85:255, 2001; Kitadi Y. et al., Int. J. Cancer, 93:662, 2001; Hashimoto I. et al., Br. J. Cancer, 85:93, 2001; Kinoshita J. et al., Breast Cancer Res. Treat., 66:159, 2001; Ueda M. et al., Gynecol. Oncol., 82:162, 2001; Salven P., Am. J. Pathol., 153:103, 1998; O-Charoenrat P. et al., Cancer, 92:556, 2001). En el caso del VEGF-D, su sobreexpresión por células tumorales está relacionada con un aumento in vivo de vasculatura linfática en los tumores y el aumento de metástasis en nódulos linfáticos (Stacker S.A. et al., Nat. Med., 7:186, 2001; Marconcini L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:9671, 1999).

Las alteraciones de la función de las células endoteliales inducidas por las moléculas de la familia de VEGF están mediadas por su unión a receptores celulres del tipo de tirosina quinasa de clase 3, que hasta la fecha incluyen: VEGFR1 (Flt1), VEGFR2 (KDR/Flk1), y VEGFR3 (Flt4) (Kalpainen A., J. Exp. Med., 178:2077, 1993). El dominio 2 N-terminal se ha identificado como el responsible de la unión a los ligandos, favoreciendo la fosforilación del dominio citoplásmico, y la transducción de la señal (Davis-Smyth T. et al., EMBO, 15:4919, 1996).

Los ligandos identificados para VEGFR1 incluyen VEGF-A, PIGF, y VEGF-B, en orden decreciente de afinidad (Shibuya M., Int. J. Biochem.... [Seguir leyendo]

1. Una composición inmunogénica que comprende un variante mutado del VEGF humano, en la que dichas mutaciones se realizan en el sitio de unión al receptor, y en la que dichos variantes mutados carecen de actividad biológica porque no pueden unirse a VEGFR2 pero reproducen las propiedades inmunogénicas del antígeno seleccionado, o sus oligonucleótidos codificantes, que comprende además opcionalmente un adyuvante farmacéuticamente aceptado.

2. Una composición inmunogénica según la reivindicación 1, en la que el adyuvante se selecciona del grupo que consiste en la partícula recombinante del antígeno nuclear de la hepatitis B, la partícula recombinante del antígeno nuclear de la hepatitis C, la proteína OPC, la proteína KLH, la proteína p64k de Neisseria meningitidis, o la VSSP

10 derivada de la membrana externa de Neisseria meningitidis.

3. Una composición inmunogénica según la reivindicación 1 ó 2, para su uso en el tratamiento de trastornos que implican un aumento de la angiogénesis, seleccionados del grupo que consiste en tumores humanos, neoplasia maligna y sus metástasis, neoplasia benigna, procesos inflamatorios crónicos, procesos autoinmunológicos, y en alteraciones oculares.