Procedimiento para la producción de una mucina (MUC1) inmunoestimulante.

Procedimiento in vitro para la producción de una molécula de MUC1,

que puede provocar una respuesta inmunitaria estimulante en el ser humano, que comprende:

(a) poner en contacto una mezcla de moléculas de MUC1 a partir del sobrenadante de células ZR-75-1 con el anticuerpo A76-A/C7 durante un periodo, que es suficiente y en condiciones, que son adecuadas, para que se forme un inmunocomplejo;

(b) aislar el inmunocomplejo; y

(c) poner a disposición la molécula de MUC1 a partir del inmunocomplejo.

Procedimiento para la producción de una mucina (MUC1) inmunoestimulante La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de una molécula de MUC1, que puede provocar una respuesta inmunitaria estimulante en el ser humano. La invención se refiere también a una molécula de MUC1 purificada, que puede obtenerse mediante el procedimiento según la invención y actúa de manera inmunoestimulante en el ser humano. Un objeto adicional de la presente invención es el uso de las moléculas de MUC1 que pueden obtenerse mediante el procedimiento según la invención para la producción de un fármaco para el tratamiento o la prevención de tumores.

La mucina MUC1 humana se denominó anteriormente entre otros también mucina epitelial polimórfica (PEM) . Hasta la fecha es la única mucina de la que se conoce que es una glicoproteína transmembrana. El polipéptido de la MUC1 está compuesto en su parte extracelular principalmente por unidades repetitivas, denominadas repeticiones en tándem, cuyo número en la población humana es polimórfico por causa genética. De manera correspondiente a la característica general de las mucinas, MUC1 también porta una gran cantidad de cadenas de hidratos de carbono unidas de manera O-glicosídica. Cada repetición en tándem está compuesta por 20 aminoácidos conservativos (NH2-HGVTSAPDTRPAPGSTAPPA-COOH) con 5 posibles sitios de O-glicosilación (dos serinas y tres treoninas) . Hasta hace poco la creencia general era que el posible sitio de glicosilación en la secuencia PDTR no está glicosilado (por ejemplo: Finn OJ, Jerome KR, Henderson RA, Pecher G, Domenech N, Magarian-Blander J, Barratt-Boyes SM. MUC-1 epithelial tumor mucin-based immunity and cancer vaccines. Imm Revs 145:61-89 (1995) , pág. 67) . Esto se justificó entre otros porque tras una inmunización de ratones con MUC1 a partir de fuentes tumorales o no tumorales se produjeron casi exclusivamente anticuerpos, que están dirigidos frente a la región PDTR, por lo que ésta también se denomina región inmunodominante. Un motivo adicional fue que los ensayos de glicosilación in vitro en este momento no pudieron lograr ninguna glicosilación en la región PDTR. Sin embargo recientemente se ha mostrado mediante investigaciones particularmente de espectrometría de masas de MUC1 de leche humana (de fuente no tumoral) que la treonina de la región PDTR de algunas repeticiones en tándem puede estar glicosilada, permaneciendo otras sin embargo sin glicosilar. Además la investigación de un grupo de anticuerpos específicos para MUC1 ha mostrado, que una glicosilación en la región PDTR intensifica o sólo posibilita la unión de anticuerpos (Ac) individuales a péptidos de MUC1 cortos en comparación con el péptido no glicosilado, mientras que otros se unen de manera completamente independiente de la glicosilación en este sitio.

MUC1 en sí misma es un marcador tumoral establecido. Las siguientes características conocidas caracterizan MUC1 como marcador tumoral: MUC1 se expresa en el epitelio normal, esencialmente en el epitelio glandular, exclusivamente de manera polar sobre la membrana apical de las células. Esta localización apical rigurosa se pierde durante la carcinogénesis y se produce una expresión apolar a través de toda la superficie celular, por lo que MUC1 se vuelve accesible para el sistema inmunitario. Una característica adicional de MUC1 es que durante la carcinogénesis se expresa de manera intensa. Como tercera característica tumoral conocida cambia la glicosilación de MUC1 durante la carcinogénesis, con lo que se produce una glicosilación aberrante. Debido a esto, por un lado, se produce la expresión de hidratos de carbono-antígenos de novo, y por otro lado parcialmente la liberación de epítopos peptídicos (Karsten, Cancer Research 58, 2541-2549, 1998; Price, Tumor Biol. supl. 1: 1-5, 1998) . MUC1 es, tal como se describe en el estado de la técnica, una molécula en sí conocida y reconocida como marcador tumoral. Sin embargo MUC1 no es una molécula estructuralmente definida con precisión sino una mezcla heterogénea de moléculas. La heterogeneidad se basa en distintas características de MUC1:

a. MUC1 es genéticamente polimórfica en la población humana con respecto al número de repeticiones en tándem.

b. La glicosilación y expresión es distinta en tejidos diferentes y en estadios de diferenciación diferentes.

c. Las preparaciones de MUC1 a partir de tejidos o líneas celulares muestran una elevada heterogeneidad en cuanto a estructuras de hidratos de carbono y con ello en cuanto a moléculas de MUC1.

d. Las preparaciones de MUC1 a partir de tejidos o líneas celulares muestran que en el interior de una molécula de MUC1 las repeticiones en tándem están glicosiladas de manera heterogénea, esto se refiere a las cadenas de azúcar, como también a los sitios de glicosilación.

e. Las técnicas disponibles actualmente no permiten la asignación de una cadena de hidratos de carbono a una repetición en tándem determinada o un sitio de glicosilación determinado de MUC1 a partir de material natural.

f. Hasta la fecha no se ha descrito completamente la glicosilación para ninguna MUC1.

En ningún caso se conoce completamente la estructura química de la molécula de MUC1 natural. Por el contrario, la glicosilación se conoce en pocos casos y entonces sólo parcialmente. Esto muestra que en el caso de MUC1 natural convencional no se trata de ninguna estructura definida, sino de un gran grupo heterogéneo de moléculas.

A esto se añade que en el caso de tumores aparecen modificaciones de la glicosilación de MUC1 por los cambios en el aparato de glicosilación, que introducen una complejidad adicional en la heterogeneidad. También esta glicosilación modificada es muy heterogénea con respecto al tipo de tumor, dentro de un tipo de tumor, con respecto

a cadenas de hidratos de carbono, distribución de las cadenas de hidratos de carbono.

Se describe que MUC1 asociada a tumores actúa de manera inmunosupresora sobre la proliferación de células T. (Agrawal et al., Nat. Med., 1998, Oct. 4 (10) :1093) . Se describe adicionalmente que a este respecto se trata en particular de moléculas de MUC1 más largas con más de 60 aminoácidos, que se obtienen a partir de células tumorales (documento WO 99/23114) . Una inmunosupresión correspondiente es extraordinariamente desventajosa o impide el uso de moléculas de MUC1 asociadas a tumores correspondientes, que se obtuvieron a partir de células. En particular se describió, que MUC1, que se obtuvo con ayuda del anticuerpo B27.29, actúa de manera inmunosupresora (documentos US 20020044943, WO 9810783) . Para una profilaxis o terapia tumoral adecuada y eficaz en base al marcador tumoral MUC1 es necesario encontrar la posibilidad de producir moléculas de MUC1, que no actúen de manera inmunosupresora o lo hagan en una medida reducida e incluso en el caso preferido actúen de manera inmunoestimulante. No se conoce una profilaxis o terapia tumoral establecida en base al marcador tumoral MUC1.

El documento DE 100 27 695 describe vacunas contra antígenos dependientes de la conformación, como por ejemplo anticuerpos anti-idiotipo contra epítopos de conformación de MUC1. Para ello se usan anticuerpos anti-MUC1 como antígeno para examinar una biblioteca de fago.

Ryuko et al. (2000) , Tumor Biol 21:197-210 describen péptidos de MUC1 glicosilados, que se unen a distintos anticuerpos anti-MUC1. No se describe que estos péptidos de MUC1 provoquen una respuesta inmunitaria estimulante en el ser humano y por otro lado son péptidos.

El documento DE 195 34 630 describe el uso del anticuerpo A76-A/C7 para la preparación de MUC1 a partir de células de tumor de mama, epitelio pancreático o carcinomas colorrectales, véase la columna 3, 23-26. No se describe que las moléculas así aisladas actúen de manera inmunoestimulante.

Snijdewint et al. (1999) , Cancer Immunol. Immunther 48:47-55 describen la obtención de MUC1 a partir del sobrenadante de células ZR-75-1 por medio de filtración y por medio del anticuerpo 139H2. La molécula de MUC1 así obtenida actúa, tal como se muestra en la ilustración 4 de D4, de manera inmunosupresora.

Price et al. (1998) , Tumor Biol 19 (supl. 1) :1-20 describen la caracterización de 56 anticuerpos monoclonales frente a MUC1. A este respecto también se usa una preparación que contiene MUC1 de la línea celular de cáncer de mama ZR-75 (véase la página 5, columna derecha) . A este respecto D5 no describe cómo se produjo la preparación que contenía MUC1 de células ZR-75.

Gimmi et al. (1996) , Nat. Med 2 (12) :1367-1370 describen la preparación de MUC-1 a partir del sobrenadante de células ZR-75.1 por medio de un anticuerpo denominado... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento in vitro para la producción de una molécula de MUC1, que puede provocar una respuesta inmunitaria estimulante en el ser humano, que comprende:

(a) poner en contacto una mezcla de moléculas de MUC1 a partir del sobrenadante de células ZR-75-1 con el anticuerpo A76-A/C7 durante un periodo, que es suficiente y en condiciones, que son adecuadas, para que se forme un inmunocomplejo;

(b) aislar el inmunocomplejo; y

(c) poner a disposición la molécula de MUC1 a partir del inmunocomplejo.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que se usa cromatografía de afinidad.

3. Procedimiento para la producción de un fármaco que comprende las etapas del procedimiento según la reivindicación 1 o 2 y que comprende además la etapa de formulación de la molécula de MUC1 en una forma farmacéuticamente compatible.

4. Uso de una molécula de MUC1 inmunoestimulante que puede obtenerse mediante un procedimiento según la reivindicación 1 o 2 para la producción de un fármaco para el tratamiento o la prevención de tumores.

5. Molécula de MUC1 inmunoestimulante que puede obtenerse mediante un procedimiento según la reivindicación 1 o 2 para su uso en el tratamiento o la prevención de tumores.

6. Molécula de MUC1 purificada, que actúa de manera inmunoestimulante en el ser humano y que puede obtenerse mediante un procedimiento según la reivindicación 1 o 2.