PRODUCCIÓN Y USO DE LÍNEAS DE CÉLULAS TUMORALES HUMANAS CD124 Y CD116 POSITIVAS EN LA PRODUCCIÓN DE AGENTES DE INMUNOTERAPIA ALOGÉNICOS O SEMIALOGÉNICOS.

Producción y uso de líneas de células tumorales humanas CD124 y CD116 positivas en la producción de agentes de inmunoterapia alogénicos o semialogénicos. La invención describe la producción de células o líneas celulares dendríticas (CD) eficaces a partir de la línea celular MUTZ-3 CD124+ y CD116+ con ayuda de las moléculas estimuladoras GM-CSF, TNF-alfa, LPS, PGE2, ligando de CD40, poliIC, calcio, PMA, TGF-beta 1, IL-7, IL-13 y/o IL-14 y además las células dendríticas humanas eficaces MUTZ-3 o una línea celular MUTZ-3 obtenibles. Las células dendríticas (CD) desempeñan un papel importante como células presentadoras de antígeno (CPA). Transmiten señales coestimuladoras que son necesarias para la activación de células T e inducen respuestas inmunes primarias mediante la presentación de antígenos a las células T CD4 + y CD8 + (Banchereau et al. 1998, Nature 392 (6673): 245-252). Las CD se desarrollan a partir de células precursoras hematopoyéticas en la médula ósea y atraviesan secuencialmente diferentes fases de diferenciación (células precursoras intermedias en la sangre y CD inmaduras en los tejidos y órganos periféricos) (Banchereau et al. 2000, Ann Rev Immunol 18: 767-811). Una vez que han llegado a los tejidos las CD inmaduras (CDi) desempeñan una importante función sensora, que se caracteriza por una captación muy activa de antígenos del medio circundante. Después de su estimulación por señales externas (señales de peligro) como por ejemplo, infecciones bacterianas o víricas o procesos inflamatorios las CD migran a los órganos linfáticos periféricos, donde se diferencian a CD maduras y activan células T a través de la presentación de antígenos. Geissmann et al. (1998), J. Exp. Med. 187: 961-966, describe que TGF-beta 1 e IL-4 inducen la diferenciación de monocitos de sangre periférica humana a células dendríticas de Langerhans. Igualmente Jaksits et al. (1999), J. Immunology 163:4869-4877 describe la diferenciación de células precursoras CD14+ derivadas de células CD34+ a células de Langerhans en presencia de GM-CSF/TNF-alfa y TGF-beta 1. También Caux et al. (1999), J. Leukoc. Biol. 66:781-791 divulgan que las células precursoras CD34+ en presencia de TGF-beta e IL-4 se pueden desarrollar a células dendríticas de Langerhans y no Langerhans. El documento US 5.811.297 describe el cultivo de células troncales hematopoyéticas CD34+ inmortalizadas en presencia de GM-CSF, TNF-alfa e IL-4, en donde estas células maduran a células dendríticas. El documento US 5.648.219 describe la línea de células dendríticas de ratón JAWS II que se puede inducir, por ejemplo, con TNF-alfa, GM-CSF o IL-4. Fairchild et al. (2000), Current Biology 10:1515-1518 describe que se pueden obtener células dendríticas a partir de células troncales embrionarias de ratón, por ejemplo, en presencia de IL-3 o GM-CSF. Paglia et al. (1993), J. Exp. Med. 178:1893-1901 divulga que una línea de células dendríticas inmortalizadas que presenta antígenos, puede ocasionar una actividad primaria de células T in vivo. Hu et al. (1996), Leukemia 10: 1025-1040 describe las líneas celulares MUTZ-2 y MUTZ-3 y observa que estas líneas celulares se pueden usar para estudios de diferenciación. Esta observación es de carácter general y no hace ninguna referencia a células dendríticas. Según métodos anteriores para la producción de CD in vitro, se obtienen dos poblaciones principales de células precursoras de CD: células CD1a + /CD14 - que se desarrollan a células de Langerhans (CL), y células CD1a - /CD14 + que se diferencian a CD intersticiales. Después del cultivo con GM-CSF e IL-4 los monocitos pueden desarrollar un fenotipo que se parece al de las CD inmaduras (CDi). Una diferenciación y maduración adicional se conseguirá mediante diferentes estímulos, como lipopolisacárido bacteriano (LPS), TNF-alfa, PGE2, ligando de CD40 o poliIC. Se han usado sistemas de cultivo definidos disponibles hasta la fecha para investigar la biología de las CD. Sin embargo, su uso para experimentos a gran escala está limitado por la dependencia de material de donantes disponible y su variabilidad. En un sistema de ratón las líneas de células dendríticas dependientes de citoquinas (GM-CSF) se han mostrado muy valiosas para el estudio de la diferenciación y desarrollo de CD en modelos de enfermedades in vitro e in vivo. Tales líneas celulares se obtuvieron mediante la inmortalización de tejido linfático o cutáneo murino. Representan un fenotipo de CD inmadura que es invariable y por tanto no permiten el análisis de los diferentes factores que participan en la diferenciación de CD. Además, debido a la heterogeneidad de las CD en los sistemas murino y humano, solo son posibles afirmaciones muy limitadas, si acaso, respecto a la biología de las CD humanas. Se pudo observar que los tumores de origen linfoide o mieloide muestran características comunes con las CPA en la ontogénesis. Estudios con PBMC de pacientes con leucemia mieloide crónica (LMC) y leucemia mieloide aguda (LMA) han mostrado que en subpoblaciones de hemoblastos de LMC y LMA se puede obtener una diferenciación en parte similar a DC a través de citoquinas, que en parte muestran una función de CPA reforzada. Por consiguiente, se 2 E02758474 02-11-2011   han intentado usar líneas celulares leucémicas establecidas como sistema modelo in vitro para la investigación sobre la biología de CD. Sin embargo, esto no funcionó, ya que todas las líneas celulares investigadas solo pueden alcanzar fases determinadas del desarrollo de CD, más allá de la cuales no se pueden diferenciar más y por tanto no pueden reflejar la biología de las CD como se deseaba. Esto es debido a que la capacidad de tales células malignas a responder a estímulos de citoquinas depende de la expresión de receptores específicos y funcionales. Sin embargo, muchas líneas celulares de leucemia no reaccionan a tratamiento con citoquinas. Otras líneas celulares de leucemia investigadas hasta ahora solo responden al tratamiento con citoquinas particulares y no se pueden desarrollar a CD efectivas a través de una diferenciación secuencial de CD. Aunque se pueden utilizar agentes farmacológicos que movilizan calcio y que por tanto evitan las rutas de señales de receptores defectuosos para inducir un fenotipo similar a CD en células mieloides, la activación de proteína quinasa C mediante PMA induce un fenotipo de CD en las línea celular de mieloblastos humanos KG-1, la manipulación de rutas de señalización intracelulares con tales agentes produce CPA que no pueden cubrir la función completa de las CD. En el caso de KG-1 estimuladas con citoquinas, por ejemplo, no se observó diferenciación sin maduración inmediata. Por tanto, las líneas celulares examinadas hasta ahora solo son adecuadas con limitación para la investigación de la biología de las CD. Estas no son adecuadas para usos inmunoterapéuticos y en sistemas de prueba para ensayar sustancias que tienen influencia en el sistema inmune. Por tanto, el estado de la técnica era que las líneas celulares leucémicas u otras líneas de células tumorales no serían capaces de diferenciarse mediante la estimulación correspondiente a CD inmaduras que, dependiendo de la estimulación, son similares a CD intersticiales o CD de Langerhans, y posteriormente a CD maduras potentes, específicamente CD de tipo 1 o CD de tipo 2. Actualmente se usan las CD en diferentes procedimientos y planteamientos para tratar diferentes enfermedades, entre ellas por ejemplo, enfermedades tumorales, enfermedades infecciosas y enfermedades autoinmunes. Los resultados han tenido éxito y son prometedores. Sin embargo, para todos estos tratamientos se deben usar actualmente CD que se obtienen de células primarias, ya que hasta ahora, a pesar de los grandes esfuerzos, no se han podido generar e identificar líneas celulares de las que producir CD que estimulen una respuesta inmune eficaz. Las desventajas de las CD de células primarias son, por ejemplo, que las CD o sus células precursoras solo se pueden obtener en cantidades muy pequeñas de pacientes o donantes, lo que limita mucho el uso de estas células, su obtención requiere una gran inversión de tiempo y trabajo técnico, la cantidad de CD obtenidas es tan pequeña que en seres humanos no se pueden usar, por mucho, cantidades proporcionales a las que en modelos en ratón pueden alcanzar los mejores resultados de tratamiento. Por tanto, las CD se deben obtener de células precursoras, como por ejemplo, células troncales CD34 positivas o monocitos, madurarlas in vitro a CD mediante una estimulación adecuada con moléculas estimuladoras, en donde las células precursoras son extremadamente raras tanto en sangre como en tejidos. Se estima que representan aproximadamente el 1% de las PBMC. Además su cultivo es complicado y está muy limitado por la... [Seguir leyendo]

1. Método para la producción de células o líneas celulares dendríticas efectivas caracterizado en que la línea celular MUTZ-3 CD124 y CD116 positiva se pone en contacto con al menos una molécula estimuladora, al mismo tiempo o de forma secuencial diferida en el tiempo, y se obtienen las células o líneas celulares dendríticas efectivas, en donde como moléculas estimuladoras se usan GM-CSF, TNF-alfa, LPS, PGE2, ligando de CD40, ácido poliinosínico-policitidílico (poliIC), calcio, PMA, TGF-beta1, IL-7, IL-13 y/o IL-4. 2. Método según la reivindicación 1, caracterizado en que como células o líneas celulares dendríticas efectivas se producen células o líneas celulares que tienen un fenotipo de células dendríticas intersticiales, células dendríticas de Langerhans, células CD83 positivas, células dendríticas inmaduras y/o células dendríticas maduras. 3. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes caracterizado en que la línea celular o células CD124 y CD116 positiva/s es/son CD34 positiva/s. 4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado en que en la línea celular o células CD116 y CD124 positiva/s se introduce el gen de CD34. 5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado en que en la línea celular o células se introducen genes adicionales que, por ejemplo, codifican y/o expresan receptores o inhibidores para moléculas estimuladoras. 6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado en que en la línea celular o células se introduce al menos un gen de un agente inmunoterapéutico, en donde el gen del agente inmunoterapéutico es un gen que codifica un antígeno tumoral, un antígeno vírico, un antígeno de parásitos, bacterias o microorganismos. 7. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado en que la línea celular o células se fusiona(n) con otras células o líneas celulares. 8. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado en que se pueden obtener diferentes fases de activación y/o capacidad efectora de las líneas celulares o células dendríticas efectivas mediante diferentes moléculas estimuladoras, su dosificación y/o mediante el orden en que se ponen en contacto. 9. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado en que la línea celular CD124 y CD116 positiva y/o las células o líneas celulares dendríticas efectivas se puede(n) llevar a apoptosis o necrosis, por ejemplo mediante irradiación de las células. 10. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado en que se puede introducir al menos un gen suicida en la línea celular o células CD124 y CD116 positivas y/o células o líneas celulares dendríticas efectivas. 11. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado en que se producen líneas celulares o células dendríticas efectivas que son CD de tipo 1 o CD de tipo 2 mediante diferentes moléculas estimuladoras, su dosificación y/o el orden en que se ponen en contacto. 12. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado en que las líneas celulares o células dendríticas efectivas se ponen en contacto con moléculas estimuladoras y se obtienen líneas celulares o células dendríticas maduras efectivas. 13. Células dendríticas efectivas humanas MUTZ-3 o línea celular MUTZ-3 obtenible(s) mediante un método de las reivindicaciones 1 a 12. 14. Células dendríticas efectivas humanas MUTZ-3 o línea celular MUTZ-3 según la reivindicación 13, que se carga(n) con al menos un antígeno. 15. Células dendríticas efectivas humanas MUTZ-3 o línea celular MUTZ-3 según la reivindicación 14, en donde el antígeno es un antígeno tumoral o antígeno de infección o una parte de los mismos. 16. Células dendríticas efectivas humanas MUTZ-3 o línea celular MUTZ-3 según la reivindicación 15, en donde el antígeno tumoral o el antígeno de infección es un péptido, proteína, lípido, lipopéptido, lipoproteína, hidrato de carbono, glicolípido, glicopéptido, glicoproteína, proteína fosforilada, péptido fosforilado, proteína o péptido modificados postraduccionalmente o donde el antígeno tumoral está codificado por ADN o ARN con el que se transfectan las células dendríticas efectivas humanas MUTZ-3. 18 E02758474 02-11-2011   17. Medicamento que comprende las células dendríticas efectivas humanas MUTZ-3 o la línea celular MUTZ-3 según cualquiera de las reivindicaciones 13, 14, 15 o 16. 18. Células dendríticas efectivas humanas MUTZ-3 o línea celular MUTZ-3 según cualquiera de las reivindicaciones 13, 14, 15 o 16 para su uso como agente inmunoterapéutico. 19. Células dendríticas efectivas humanas MUTZ-3 o línea celular MUTZ-3 según cualquiera de las reivindicaciones 13, 14, 15 o 16 para su uso en la profilaxis o tratamiento de enfermedades infecciosas, tumorales y/o autoinmunes. 20. Células dendríticas efectivas humanas MUTZ-3 o línea celular MUTZ-3 según la reivindicación 13 para su uso para el procesamiento y/o presentación de antígenos. 21. Células dendríticas efectivas humanas MUTZ-3 o línea celular MUTZ-3 según la reivindicación 20, en donde los antígenos son péptidos, proteínas, lípidos, lipopéptidos, lipoproteína, hidratos de carbono, glicolípidos, glicopéptidos, glicoproteínas, proteínas fosforiladas y/o péptidos fosforilados. 22. Sistema de prueba que comprende las células dendríticas efectivas humanas MUTZ-3 o la línea celular MUTZ-3 según la reivindicación 13. 23. Sistema de prueba según la reivindicación 22, en donde el sistema de prueba se usa para el ensayo de sustancias inmunoactivadoras, inhibidoras o moduladoras. 24. Sistema de prueba según la reivindicación 22, en donde el sistema de prueba se usa para el ensayo de vacunas tumorales o la influencia de sustancias químicas, agentes farmacológicos, cosméticos o productos alimenticios en el sistema inmune. 19 E02758474 02-11-2011   Figura 1 E02758474 02-11-2011   Figura 2 21 E02758474 02-11-2011   Figura 3 22 E02758474 02-11-2011   Figura 4 23 E02758474 02-11-2011   Figura 5 24 E02758474 02-11-2011   Figura 6 E02758474 02-11-2011   Figura 7 26 E02758474 02-11-2011   Figura 8 27 E02758474 02-11-2011   Figura 9 28 E02758474 02-11-2011   Figura 10 29 E02758474 02-11-2011   E02758474 02-11-2011   31 E02758474 02-11-2011