Un procedimiento para la determinación de la presencia de tumores colorectales o lesiones pre-cancerosas en un sujeto humano,

que comprende: a) extracción de ADN de muestras de cepas: b) amplificación por PCR de 8 fragmentos de ADN diferentes que se extienden en diferentes regiones de genes p53 y APC, usando deoxinucleótidotrifosfatos o cebadores etiquetados con moléculas fluorescentes, en la que se amplifican fragmentos de p53 que corresponden a exones 5-8 usando los siguientes pares de cebadores: y se amplifican fragmentos APC usando los siguientes pares de cebadores: c) cuantificación de los fragmentos amplificados (amplicones); d) cálculo de la cantidad total de diferentes amplicones; e) comparación de los valores obtenidos en (d) con un valor de referencia, en el que el valor de referencia se determina en base a series de casos que comprenden sujetos sanos y pacientes afectados por tumor o lesiones colorrectales

Esta presente invención se refiere en general al diagnóstico de tumores en pacientes humanos y animales. De forma específica proporciona un procedimiento y kit para el diagnóstico precoz de carcinoma colorrectal y determinación de lesiones pre-cancerosas del colon y recto. El procedimiento de la invención se basa en la cuantificación de ADN extraído de cepas y amplificado con técnicas de PCR (reacción en cadena de la polimerasa). 5

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

En los últimos años se ha acumulado una gran cantidad de información sobre las alteraciones moleculares que tienen lugar durante el desarrollo de tumores, tal como mutaciones de genes o redisposiciones genómicas, vislumbrando la posibilidad de detectar alteraciones tumorales en fluidos biológicos y en consecuencia indicando el uso de estos marcadores como un enfoque de diagnóstico no invasivo válido. 10

Un tumor que se ha investigado ampliamente con este enfoque es el cáncer colorrectal, que es una de las formas más comunes de cáncer en todo el mundo, con un resultado clínico que varía considerablemente de acuerdo con el tipo de lesión y fase de enfermedad en el diagnóstico (1-3). Un diagnóstico precoz es fundamental para reducir la morbididad y mortalidad ya que un gran porcentaje de pacientes diagnosticados en las fases previas de la enfermedad sobreviven a largo plazo (4). Además la posibilidad de detectar lesiones pre-cancerosas hace de este 15 tumor una diana ideal para los programas de seguimiento. Sin embargo, si bien se encuentran disponibles diversos procedimientos de seguimiento, un alto porcentaje de individuos no participan en los programas de seguimiento de cáncer colorrectal. Hay muchas razones para esta baja implicación, tal como una falta de conocimiento de los beneficios de los procedimientos de seguimiento disponibles, especialmente colonoscopia, así como también los procedimientos no complacientes y problemáticos (5). 20

Se han investigado repetidamente mutaciones de genes en cepas, especialmente K-ras (6-12) y en una menor extensión p53 (13), gen APC (14, 15) e inestabilidad microsatelital (16). Los resultados han mostrado la presencia de estas alteraciones moleculares en cepas en sólo una fracción de pacientes, debido a la frecuencia relativamente baja de alteraciones de marcador único en cáncer colorrectal. Se han analizado múltiples mutaciones en paralelo a la misma muestra de cepa y este enfoque ha conducido a mejor sensibilidad de la prueba, pero es cara, lleva tiempo y no 25 se puede aplicar fácilmente a programas de seguimiento (17-21).

Se ha considerado recientemente el potencial de diagnóstico de la amplificación de ADN de células exfoliadas en cepa. Evidencias preliminares (19-21) han mostrado que la evaluación semi-cuantitativa de amplificación de ADN (L-ADN) de algunos fragmentos de ADN mayores de 200 bp detecta más del 50% de cánceres colorectales con una especificidad muy alta. 30

La solicitud de EEUU nº 20020004206 divulga un ensayo genético para la identificación de una enfermedad tumoral de muestras que contienen células epiteliales exfoliadas. La solicitud de patente describe un ensayo que comprende una etapa de amplificación por PCR de fragmentos de Kras, APC y p53, seguido de determinación semi-cuantitativa del ADN amplificado basado en tinción con gel.

El documento US 5723298 divulga un procedimiento para el etiquetado y secuenciación de moléculas de 35 ácido nucleico, de forma particular moléculas de ADN en las que se alarga un cebador etiquetado internamente, extendido parcialmente en una reacción de extensión del cebador ciclado, y un kit para la preparación de muestras para análisis de secuencia de ácido nucleico que comprende un cebador de ácido nucleico no etiquetado, un dNTP etiquetado, tres dNTPs no etiquetados, una polimerasa termoestable y un tampón de reacción de la polimerasa termoestable. 40

El documento WO 01/42502 divulga un procedimiento para la detección de enfermedad que comprende, entre otros, llevar a cabo una amplificación de PCR de ADN purificado en muestras de cepa en pacientes que presentan cáncer colorrectal. Los cebadores usados en dicho procedimiento de amplificación se diseñan para amplificar 5 ó 7 locus diferentes de ADN que permiten la amplificación del fragmento de ADN que presenta una longitud mayor de 200 bp. La cantidad de amplicones se compara luego con un valor de referencia. Se usa tinción con bromuro de etidio para 45 la cuantificación de ADN amplificada.

El documento WO 02/092858 divulga procedimientos para el seguimiento de enfermedades. Uno de los procedimientos descritos en este documento comprende llevar a cabo un procedimiento de diagnóstico para detectar la presencia de una muestra biológica de ácidos nucleicos específicos de especie indicativos de cáncer o pre-cáncer. Dicho procedimiento comprende la amplificación de ácidos nucleicos en una muestra de cepa representativa que usa 50 cebadores específicos de humanos y que detecta amplicones que presentan más de 200 bp mediante tinción con bromuro de etidio, seleccionándose los cebadores de PCR para detectar de forma específica genes que se sabe o se sospecha están asociados con cáncer colorrectal. En dicho procedimiento la amplificación por PCR se diseña para amplificar 7 locus diferentes con una longitud que presenta al menos 200 bp. El resultado de la amplificación se compara luego con un valor de referencia. 55

Rengucci y col., Clinical Cancer Research, 7: 590-593 (2001), divulga la detección de alteraciones genéticas, de forma particular p53 y mutaciones k-ras e instabilidad microsatelital, para el seguimiento de tumores colorectales.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se basa en un enfoque nuevo, exacto y rápido para la detección de cáncer, que permite una mejor discriminación entre individuos afectados y no afectados. 5

De forma específica el objeto de la invención es un procedimiento para la cuantificación de ADN en muestras de cepa, útil para el diagnóstico previo de tumores y lesiones de pre-cancerosas del colon y recto, que comprende las siguientes etapas:

a) extracción de ADN de muestras de cepas:

b) amplificación PCR de 8 fragmentos de ADN diferentes que extiende diferentes regiones de genes p53 y APC, 10 usando deoxinucleótidotrifosfatos o cebadores etiquetados con moléculas fluorescentes,

en la que se amplifican fragmentos de p53 que corresponden a exones 5-8 usando los siguientes pares de cebadores:

y se amplifican fragmentos APC usando los siguientes pares de cebadores:

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c) cuantificación de los fragmentos amplificados (amplicones);

d) cálculo de la cantidad total de diferentes amplicones;

e) comparación de los valores obtenidos en (d) con un valor de referencia, en el que el valor de referencia se determina en base a series de casos que comprenden sujetos sanos y pacientes afectados por tumor o lesiones colorrectales.

La extracción de ADN se puede llevar a cabo mediante técnicas convencionales usando kits comercialmente 20 disponibles. Los fragmentos de ADN amplificados en la etapa (2) puede extenderse en una o más regiones genómicas que no se solapan, incluyendo secuencias de genes y no de codificación, procurando que la longitud del fragmento no supere 100 bp (pares de bases), preferiblemente entre 100 y 1000 bp, y más preferiblemente entre 100 y 500 bp. Los fragmentos se pueden amplificar por separado o simultáneamente; en este último caso los productos de amplificación se deberían distinguir uno del otro mediante etiquetado fluorescentes apropiado. Preferiblemente los oligonucleótidos 25 de cebador o deoxinucleótidotrifosfatos usados en la reacción de amplificación portan las siguientes moléculas fluorescentes (fluorocromos): HEX (Applied Biosystems), 6-FAM (Applied Biosystems) y TAMRA (Applied Biosystems), u otras moléculas tales como fluoresceína, rodamina, Cy3, Cy5, 5-FAM Ned, Vic y Pet. Los marcadores se unen químicamente con uno o más nucleótidos dentro o en los extremos de las secuencias del cebador, preferiblemente en el primer residuo de nucleótido, o con los deoxinucleótidotrifosfatos presentes en la mezcla de reacción de PCR. 30

Se amplifican los siguientes fragmentos de genoma: exones 5 a 8 de p53 (Banco de genes nº X54156, nt. 13042-13253, 13308-13489, 13986-14124, 14404-14603); y regiones genómicas que codifican aminoácidos 862-954,...

1. Un procedimiento para la determinación de la presencia de tumores colorectales o lesiones pre-cancerosas en un sujeto humano, que comprende:

a) extracción de ADN de muestras de cepas:

b) amplificación por PCR de 8 fragmentos de ADN diferentes que se extienden en diferentes regiones de 5 genes p53 y APC, usando deoxinucleótidotrifosfatos o cebadores etiquetados con moléculas fluorescentes,

en la que se amplifican fragmentos de p53 que corresponden a exones 5-8 usando los siguientes pares de cebadores:

y se amplifican fragmentos APC usando los siguientes pares de cebadores: 10

c) cuantificación de los fragmentos amplificados (amplicones);

d) cálculo de la cantidad total de diferentes amplicones;

e) comparación de los valores obtenidos en (d) con un valor de referencia, en el que el valor de referencia se determina en base a series de casos que comprenden sujetos sanos y pacientes afectados por tumor o 15 lesiones colorrectales.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dichas moléculas fluorescentes se seleccionan de HEX, 6-FAM y TAMRA.

3. Un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 2, en el que las cantidades de amplicón se interpolan en una curva de calibración obtenida de cantidades de ADN conocidas. 20

4. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los amplicones se cuantifican con un secuenciador/analizador automático o usando sistemas de detección fluorimétricos, colorimétricos, radioactivos o espectrofotométricos.

5. Un kit que contiene los cebadores de la reivindicación 1 marcados con moléculas fluorescentes de acuerdo con la reivindicación 2, un ADN polimerasa termoestable e instrucciones para el usuario para llevar a cabo el 25 procedimiento de las reivindicaciones 1-4.