DISEÑO DE ANTICUERPOS MONOCLONALES DESINMUNIZADOS PARA LA PROTECCIÓN CONTRA LA EXPOSICIÓN AL VIH Y EL TRATAMIENTO DE LA INFECCIÓN POR VIH.

Anticuerpo monoclonal desinmunizado que comprende (i) un fragmento de cadena pesada de anticuerpo Fv seleccionado a partir del grupo que consiste en los Numeros de Identificacion de Secuencia 5,

6, 7 y 8, (ii) un fragmento de cadena liviana de anticuerpo Fv seleccionado a partir del grupo que consiste en los Numeros de Identificacion de Secuencia 9, 10 y 11, y (iii) regiones constantes de IgG1 humana, en donde la Asn297 de la IgG1 se somete a N-aglicosilacion mediante la eliminacion de la Asn297 mediante mutacion a otro aminoacido

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Antecedentes de la invención

A pesar de la intensa investigación en la búsqueda de una vacuna en los 20 años transcurridos desde el descubrimiento inicial del VIH como el agente causante del Síndrome de la Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA), y a 18 años de la clonación molecular y la caracterización del virus del SIDA, siguen existiendo importantes obstáculos para el desarrollo de la inmunoterapia para el tratamiento del virus del SIDA. Estos obstáculos incluyen la hipervariabilidad del VIH tipo 1 (VIH-1, el tipo de VIH más importante), las múltiples vías y/o modos de transmisión del virus, y una falta de comprensión de las respuestas inmunes necesarias para la inhibición del VIH.

En un análisis realizado por Moore et al. [1], se informa que los anticuerpos generados contra epítopos expuestos variables tienen actividad neutralizante efectiva sólo contra virus autólogos y aislados con proteínas de envoltura estrechamente relacionadas (env). Además, los anticuerpos monoclonales (mAbs) que reconocen las regiones de env más conservadas, dianas de mejor potencial inmunoterapéutico, casi nunca neutralizan claramente los aislados primarios. El conocimiento básico necesario para el logro de anticuerpos antivirales amplios sigue siendo tan enigmático que el campo de la vacunología del VIH se centra en la actualidad en enfoques que ofrecen, en el mejor de los casos, sólo la esperanza de una protección parcial contra la enfermedad [2].

Los aislados primarios de VIH-1 se obtienen mediante el cultivo limitado de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) del paciente, o el plasma del paciente con PBMC no infectadas. Son muy parecidas a las cepas de campo de VIH que son las responsables de la infección humana [3]. Los aislados primarios se diferencian fácilmente de los virus T-trópicos adaptados en laboratorio utilizados habitualmente, tales como IIIb/LAI, SF2, y MN, que se han reproducido y se encuentran bien adaptados al cultivo en líneas celulares T-linfoides humanas.

En primer lugar, la mayoría de los aislados primarios de VIH-1 son M-trópicos. No crecen fácilmente en líneas celulares T cultivadas, sino más bien son monocito- o macrófago-trópicos con la habilidad de infectar linfocitos T primarios [4]. En segundo lugar, los aislados primarios son altamente resistentes a la neutralización in vitro mediante las formas recombinantes solubles de la proteína receptora CD4 (rsCD4) de virus y requieren 200-2700 veces más rsCD4 que las cepas de laboratorio para una neutralización similar [5]. En tercer lugar, los aislados primarios también son resistentes a los anticuerpos de neutralización obtenidos mediante la utilización de vacunas gp120 [6].

Los aislados primarios incluyen tanto a los aislados inductores de sincitio (SI) como a los aislados que no inducen sincitio (NSI) en el cultivo de PBMC. La mayoría de los aislados primarios SI se replicarán en la línea celular T MT2 altamente sensible al VIH, pero pocas se pueden replicar en las líneas celulares T transformadas CEM o H9 menos permisivas que se utilizan habitualmente para cultivar los aislados adaptados en laboratorio. Los aislados primarios que no inducen sincitio (NSI) sólo pueden cultivarse en los linfocitos T primarios a partir de sangre periférica.

Hubo un equivocado optimismo inicial por las respuestas eficaces de anticuerpos a las vacunas de subunidad de la envoltura de VIH-1 recombinante (por ejemplo, las vacunas gp120 y gp160). Los sueros de los vacunados a partir de ensayos clínicos de las vacunas en base a envolturas experimentales habitualmente eran capaces de neutralizar los aislados de laboratorio de VIH-1 in vitro [7, 8]. En ese momento, las diferencias básicas entre los aislados adaptados en laboratorio y los primarios no se comprendían todavía. Este optimismo se derrumbó rápidamente cuando se descubrió que los anticuerpos en los sueros de los vacunados eran, en gran medida, inefectivos para la neutralización de los aislados primarios de VIH-1 de los pacientes [6, 9].

El optimismo inicial por la efectividad de los anticuerpos inducidos por vacunas se aportó equívocamente a partir de los estudios sobre preparaciones de virus inactivados de Virus de Inmunodeficiencia en Simios (SIV). Debido a las similitudes entre el VIH-1 y el SIV en morfología, organización genética, procesos de infección y enfermedad, la infección SIV en monos rhesus parecía ser un modelo excelente para explorar diferentes estrategias de vacunas contra el SIDA y anticuerpos contra el VIH. Los estudios iniciales en el modelo SIV mostraron que las preparaciones inactivadas de SIV cultivadas en líneas celulares T humanas y formuladas en adyuvante pueden proteger a los macacos de la infección después de la inoculación experimental con variantes patógenas altamente infecciosas de SIV cultivado en células humanas [10]. De forma inesperada, esta protección se perdió cuando se utilizó una cepa de SIV cultivada en células de mono homólogas para el desafío de animales inmunizados.

Los estudios de inmunización posteriores con SIV cultivado en células de mono y células humanas no infectadas mostraron que la protección contra la infección en aquellos primeros estudios de SIV, probablemente fueron el

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resultado de la estimulación de las respuestas inmunes a las proteínas celulares huésped humanas xenogénicas y no a los antígenos codificados por virus [11]. Los experimentos de inmunización pasiva que involucran al SIV sugirieron que determinados anticuerpos anticelulares podrían contribuir a la protección contra la infección de SIV ante la ausencia de inmunidad mediada por células [12].

No se ha delineado el mecanismo mediante el cual los anticuerpos anticelulares proporcionan inmunidad protectora contra el desafío retroviral. Un modo de acción para tal protección se puede mediar mediante el bloqueo del punto de unión del CD4 para los virus de inmunodeficiencia en las células del sistema inmune. Se sabe hace mucho tiempo que los anticuerpos monoclonales anti-CD4 bloquean la infección en una forma que depende del epítopo de CD4, no de la cepa del virus [13, 14]. El anticuerpo monoclonal 5A8, que reconoce el dominio 2 del CD4, había mostrado eficacia terapéutica en los macacos infectados con SIV [15]. Los anticuerpos monoclonales anti-CD4 Leu3A y P1, que reconocen el bucle tipo CDR2 en el dominio 1 del CD4, bloquearon la infección de los cultivos celulares mediante aislados primarios [5, 14].

Los anticuerpos anti-CD4 inhiben la transmisión de virus a célula o de célula infectada a célula no infectada tanto de las cepas SI como NSI de VIH 1 [16]. La superficie de los linfocitos T huésped parece tener un complejo de antígeno de células huésped asociado con el CD4 que facilita el vínculo y la entrada viral y actúa como diana para los anticuerpos anticélulas protectores [17, 18].

El anticuerpo monoclonal murino B4 (mAb B4) [17, 18] es un anticuerpo anticélula desarrollado mediante la utilización de linfocitos T que expresan CD4, tales como los linfocitos T mononucleares de sangre periférica, los timocitos, esplenocitos o líneas celulares T derivadas de leucemia o linfoma, por ejemplo, HPB-ALL o SUP-T1. El mAb B4 se caracterizó por su habilidad para neutralizar los aislados primarios de VIH-1 y los virus de inmunodeficiencia relacionados tanto in vitro como in vivo. Específicamente, el mAb B4 actúa mediante el bloqueo de la unión del VIH con las células huésped de CD4+. Es un inhibidor de entrada, una nueva clase de fármacos antiretrovirales para el tratamiento de la infección del VIH, proporcionando potencialmente una terapia ortogonal a la terapia antirretroviral altamente activa (HAART, por sus siglas en inglés).

El mAb B4 se dirigió contra un complejo de antígeno de superficie de célula huésped que comprendía proteína CD4 en asociación con los dominios a partir de receptores de quimiocina. El mAb B4 reconoce el CD4 mediante un punto de unión de región extracelular de CD4 en el bucle tipo CDR2 en el dominio 1. Este no coincide con el punto de unión para el Leu3A. La patente Estadounidense Número 5,912,176 revela evidencia sólida que indica que este anticuerpo B4 tiene actividades neutralizantes amplias contra los aislados a partir de todos los clados de VIH-1 y los aislados primarios de VIH tipo 2 (VIH-2) y de SIV. Al mezclar anticuerpos monoclonales con especificidades para diferentes antígenos de superficie celular, sólo aquellas mezclas que incluían mAb B3... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo monoclonal desinmunizado que comprende

(i) un fragmento de cadena pesada de anticuerpo Fv seleccionado a partir del grupo que consiste en los Números de Identificación de Secuencia 5, 6, 7 y 8, (ii) un fragmento de cadena liviana de anticuerpo Fv seleccionado a partir del grupo que consiste en los Números de Identificación de Secuencia 9, 10 y 11, y

(iii) regiones constantes de IgG1 humana,

en donde la Asn297 de la IgG1 se somete a N-aglicosilación mediante la eliminación de la Asn297 mediante mutación a otro aminoácido.

10 2. Anticuerpo monoclonal desinmunizado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el fragmento de la cadena pesada del anticuerpo Fv es el Número de Identificación de Secuencia: 5 y el fragmento Fv de la cadena liviana del anticuerpo es el Número de Identificación de Secuencia: 9.

3. Polinucleótido que comprende las regiones codificantes para el anticuerpo monoclonal desinmunizado de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2.

15 4. Célula huésped recombinante que secreta el anticuerpo monoclonal desinmunizado de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2.

5. Anticuerpo monoclonal desinmunizado de acuerdo con la reivindicación 1 para la utilización como medicamento.

6. Anticuerpo monoclonal desinmunizado de acuerdo con la reivindicación 1 para la utilización en la prevención o el tratamiento de la infección por VIH en un humano.