Un procedimiento para diagnosticar o monitorizar la progresión de una poliquistosis renal (PQR) que comprende detectar una proteína relacionada con Frizzled secretada (sFRP) en una muestra que contiene orina o suero obtenida de un individuo que padece PQR o que se sospecha que padece PQR,

en el que dicha sFRP es proteína 4 relacionada con Frizzled secretada (sFRP4) que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:4

La presente invención se refiere al diagnóstico de poliquistosis renales (PQR). La invención proporciona procedimientos para diagnosticar o monitorizar la progresión de PQR y el uso de kits de prueba en esos procedimientos.

La PQR es una enfermedad hereditaria común asociada a insuficiencia renal. Aunque el crecimiento de quistes y la compresión del tejido circundante pueden explicar algo de pérdida de tejido renal, la naturaleza de la insuficiencia renal 5 progresiva en pacientes con PQR es desconocida.

La poliquistosis renal dominante autosómica (PQRAD) se produce en aproximadamente 1 de 1000 seres humanos, y produce insuficiencia renal terminal (IRT) en más del 50 % de todos los pacientes afectados. La formación de quistes se inicia durante la embriogénesis, pero normalmente no altera la función renal hasta más tarde en la vida. Las mutaciones de tanto PQR1 como PQR2 producen la enfermedad, pero sigue siendo inalcanzable por qué los quistes presentes en menos 10 de un uno por ciento de todas las nefronas producen insuficiencia renal. Aunque la proliferación persistente, la secreción de fluido y la expansión de quistes pueden dañar el tejido circundante por cambios reactivos de la matriz extracelular, el aumento de la apoptosis del parénquima sano parece ser el principal culpable de la insuficiencia renal progresiva. Las células epiteliales aisladas de riñones quísticos muestran un aumento de los niveles de expresión proto-oncogénica, una localización errónea de proteínas de la membrana integral y una secreción de fluidos activa, pero estas alteraciones no 15 explican la acelera pérdida de tejido in vivo.

Se están desarrollando medicamentos de los cuales puede esperarse un efecto terapéutico en el tratamiento de PQR (por ejemplo, antagonistas del receptor de vasopresina 2 e inhibidores de mTOR). Los estudios clínicos de fase II/III para estas sustancias se iniciarán el próximo año. Sin embargo, todavía no se sabe cómo podría monitorizarse la eficiencia terapéutica a corto plazo (es decir, dentro de un periodo de aproximadamente uno a aproximadamente cuatro años). Como 20 la enfermedad se desarrolla durante el transcurso de muchos años, es difícil determinar si una intervención terapéutica inhibirá eficientemente o no la progresión de la enfermedad. Actualmente, la medición de la cantidad de creatinina en suero (aclaramiento de creatinina) como marcador de la función renal es el único procedimiento disponible. Sin embargo, este procedimiento tiene la desventaja de que la función renal sigue normal aunque los quistes ya se hayan desarrollado espectacularmente con el transcurso de los años. Como consecuencia, la medición de creatinina en suero no es adecuada 25 para monitorizar la progresión de PQR o para determinar la eficiencia terapéutica de un medicamento.

Por tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento para determinar la eficiencia de un tratamiento terapéutico de PQR. Otro objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento para diagnosticar PQR.

Se ha descubierto de manera sorprendente que la formación de quistes está asociada a un aumento de la 30 producción y la acumulación de proteína 4 relacionada con Frizzled secretada (sFRP4). La sFRP4 es un miembro de una familia en desarrollo de moléculas solubles que se unen tanto a moléculas de Wnt como de Frizzled. La sFRP4 es un factor soluble que antagoniza la señalización de Wnt y produce apoptosis. Además, se ha encontrado inesperadamente que la sFRP4 y otros miembros de la familia de las proteínas relacionadas con Frizzled secretadas están presentes en el suero y se excretan en la orina de pacientes con PQR y que la producción de sFRP4 establece una correlación con el grado del 35 volumen de quistes y la fase de insuficiencia renal. Además, la sFRP5 puede detectarse específicamente en la orina de pacientes con PQR.

Por tanto, la presente invención se refiere a un procedimiento para diagnosticar o monitorizar la progresión de PQR como se define en las reivindicaciones. La PQR puede ser adquirida o heredada. La PQR puede asociarse a o producirse por mutaciones en el (los) gen(es) PQR1 y/o PQR2. Por consiguiente, en una realización preferida la presente invención se 40 refiere a un procedimiento para diagnosticar o monitorizar la progresión de PQR que comprende detectar proteína 4 relacionada con Frizzled secretada que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 4 en una muestra que contiene orina o suero obtenida de un individuo que padece PQR o que se sospecha que padece PQR.

Donauer y col. (2003), Journal of the American Society of Nephrology, vol. 14, Abstracts issue, página 106A, describen que el ARNm de sFRP4 está regulado por incremento en riñones extirpados de pacientes con poliquistosis renal 45 (PQR). Sin embargo, sólo se detectó ARNm, pero no proteína. En muchos casos, la verificación de datos de micromatrices ha revelado que el ARNm de genes regulados por incremento no se traduce necesariamente en un aumento de la producción de proteína. Segundo, los riñones examinados en ese documento se extirparon de pacientes con insuficiencia renal terminal (IRT). Los hallazgos en esta población no reflejan necesariamente los cambios en la expresión génica y la producción de riñones con PQRAD funcionantes. Tercero, la detección de sFRP4 por RT-PCR no implica complejos 50 anticuerpo-antígeno, pero se basa completamente en la transcripción inversa de ARNm en ADNc, y la detección de este ADNc por PCR y electroforesis en gel. La inmunoquímica no se realizó para sFRP4. La presente invención no se refiere al descubrimiento de que el ARNm está regulado por incremento en pacientes con PQR con insuficiencia renal terminal, sino que se basa en un aumento de la producción de sFRP4 en pacientes con PQR con riñones funcionantes. Es probable que numerosos genes sean inducidos por uremia y/o terapia de reemplazo renal, y la especificidad sigue siendo cuestionable. En 55 la técnica anterior no se ha informado del hallazgo de que la sFRP4, además de otros miembros de la familia de sFRP, son detectables en la orina y la sangre de pacientes con riñones funcionantes.

Berndt y col. (2003) The Journal of Clinical Investigation 112(5), 785 describen estudios sobre la actividad

fosfatúrica de sFRP4. Sin embargo, estos estudios no se relacionaron con PQR. Además, este documento no revela que la sFRP4 pueda estar presente en el suero o la orina de sujetos que padece una enfermedad renal quística.

Zheng y col. (J. Am. Soc. Nephrol. 14: 2588-2595, 2003) describen estudios sobre la excreción urinaria de la proteína quimioatrayente de monocitos 1 (MCP-1) en PQRAD. Esta publicación no desvela la detección de sFRP4 ni de sFRP5. 5

El documento WO 02/05857 A2 desvela la secuencia de aminoácidos de FRP-4 humana y describe una posible función de esta proteína en la homeostasis y el transporte de fosfato. No enseña la detección de sFRP4 ni de sFRP5 para monitorizar o diagnosticar PQR.

Los términos “proteína relacionada con Frizzled secretada” y “sFRP” se usan indistintamente en este documento. Las sFRP incluyen, pero no se limitan a, sFRP1, sFRP2, sFRP3, sFRP4 y sFRP5. La sFRP puede unirse preferentemente 10 tanto a moléculas de Wnt como a una o más de Frizzled.

El término “proteína 1 relacionada con Frizzled secretada” o “sFRP1” denota una proteína que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:1 (Figura 7). Preferentemente, la sFRP1 es una proteína que está constituida sustancialmente por la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:1. La sFRP1 también incluye variantes de proteínas de la secuencia que se muestra en SEQ ID NO:1, por ejemplo, debido a 15 variación alélica. Las variantes pueden tener mutaciones con respecto a la secuencia que se muestra en SEQ ID NO:1, por ejemplo, sustituciones, adiciones y/o deleciones. Uno de 30, o uno de 20, o uno de diez, o uno de cinco, o uno de tres aminoácidos pueden estar sustituidos, delecionados y/o añadidos con respecto a la secuencia que se muestra en SEQ ID NO:1.

El término “proteína 2 relacionada con Frizzled secretada” o “sFRP2” denota una proteína que tiene 20 sustancialmente la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:2 (Figura 7). Preferentemente, la sFRP2 es una proteína que está sustancialmente constituida por la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:2. La sFRP2 también incluye variantes de proteínas de la secuencia... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para diagnosticar o monitorizar la progresión de una poliquistosis renal (PQR) que comprende detectar una proteína relacionada con Frizzled secretada (sFRP) en una muestra que contiene orina o suero obtenida de un individuo que padece PQR o que se sospecha que padece PQR, en el que dicha sFRP es proteína 4 relacionada con Frizzled secretada (sFRP4) que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:4. 5

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha muestra es una muestra de orina.

3. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha muestra es una muestra de suero.

4. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la detección de un nivel elevado de la sFRP4 en la muestra del individuo con respecto a muestras de control indica un diagnóstico de PQR, o en el que el grado de elevación de la sFRP4 en la muestra del individuo con respecto a muestras de control establece una 10 correlación con la progresión de PQR en el individuo.

5. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la detección comprende poner en contacto la muestra con al menos un anticuerpo que puede unirse a la sFRP4 para permitir la formación de complejos anticuerpo-antígeno y detectar la presencia de complejos anticuerpo-antígeno formados.

6. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el procedimiento comprende al 15 menos un inmunoensayo directo o indirecto seleccionado del grupo que está constituido por un ensayo de unión competitiva, un ensayo de unión no competitiva, un radioinmunoensayo, un enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), un ensayo de tipo sándwich, una reacción de precipitina, un ensayo de inmunodifusión de difusión en gel, un ensayo de aglutinación, un inmunoensayo fluorescente, inmunoensayo de quimioluminiscencia, inmunoensayo de inmunoPCR, un inmunoensayo de proteína A o proteína G y un ensayo de inmunoelectroforesis. 20

7. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que al menos dos muestras obtenidas del mismo individuo en momentos diferentes se criban para la presencia de la sFRP4.

8. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende detectar tanto sFRP4 como sFRP5 en dicha muestra.

9. El uso de una proteína relacionada con Frizzled secretada (sFRP) en una muestra que contiene orina o suero 25 como marcador para la progresión de PQR, en el que dicha sFRP es proteína 4 relacionada con Frizzled secretada (sFRP4) que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:4.

10. El uso de un kit de diagnóstico que comprende al menos un anticuerpo que puede unirse a sFRP4 en un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicha sFRP4 tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:4. 30

11. El uso según la reivindicación 10, caracterizado porque dicho anticuerpo puede unirse a sFRP4 presente en orina humana.

12. El uso según la reivindicación 10 u 11, en el que el anticuerpo no reacciona de forma cruzada con otras proteínas presentes en orina humana.

13. El uso según la reivindicación 12, en el que el anticuerpo es específico para sFRP4. 35

14. El uso según la reivindicación 10 u 11, en el que el anticuerpo puede unirse a sFRP1, sFRP2, sFRP3, sFRP4 y sFRP5.

15. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en el que el anticuerpo está inmovilizado sobre una fase sólida.

16. El uso según la reivindicación 15, en el que la fase sólida es una tira reactiva. 40

17. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16, en el que dicho kit comprende además un segundo anticuerpo que puede unirse específicamente a sFRP4.

18. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17, en el que dicho kit comprende además un concentrado de tampón de lavado y/o una composición que comprende sFRP4.