Miméticos sintéticos de LTA y uso de los mismos como componente de vacuna para la terapia y/o profilaxis de infecciones gram-positivas.

Un mimético sintético de ácido lipoteicoico (LTA) que tiene la siguiente fórmula general (III)**Fórmula**

en donde z es un número entero seleccionado de 1 a 40,

y preferiblemente seleccionado de 4 a 6, en donde R1 se selecciona de H o un resto carbohidrato, y

L es un resto enlazador para conectar dicho mimético a una proteína de soporte adecuada,

o sales o solvatos del mismo.

Miméticos sintéticos de LTA y uso de los mismos como componente de vacuna para la terapia y/o profilaxis de infecciones gram-positivas

La presente invención se refiere a miméticos sintéticos del ácido lipoteicoico (LTA) que son útiles como componentes de vacunas para la terapia y/o profilaxis de la infección bacteriana.

Antecedentes de la invención

Los enterococos se encuentran entre los patógenos más importantes asociados con infecciones en pacientes hospitalizados. Especialmente la presencia de determinantes de resistencia a múltiples antibióticos en la mayoría de los aislados clínicamente relevantes insta al desarrollo de estrategias de prevención y tratamiento alternativas para combatir estas infecciones a veces intratables. Los enterococos han desarrollado mecanismos específicos para adquirir y transmitir el ADN horizontalmente, y estos rasgos son los responsables de numerosos brotes en el ámbito hospitalario.

Existen al menos 15 especies de enterococos, pero sólo dos de ellas están comúnmente asociadas con la infección clínica, a saber, Enterococcus faecalis, que es responsable del 80% las infecciones causadas por enterococos y Enterococcus faecium. La bacteria Gram-positiva Enterococcus faecalis es un habitante natural del tracto gastrointestinal de los mamíferos, y se encuentra comúnmente en el suelo, las aguas residuales, el agua y los alimentos, con frecuencia a través de la contaminación fecal (Klare, I., Werner, G. y Witte, W. Contrib. Microbiol. 2001, 8, 108-22).

Cepas sensibles de estas bacterias pueden ser tratadas con ampicilina y vancomicina. No obstante, algunos enterococos son resistentes a antibióticos basados en (3-lactama (intrínsecamente contra todas las cefalosporinas y, en algunos casos, adquiridos contra penicilinas a través de una beta-lactamasa), así como los aminoglucósidos (resistencia intrínseca de bajo nivel, resistencia de alto nivel adquirida). En las dos últimas décadas, cepas particularmente virulentas de Enterococcus que son resistentes a la vancomicina (Enterococcus resistentes a la vancomicina, o VRE) han surgido en las infecciones nosocomiales de pacientes hospitalizados, especialmente en los EE.UU., pero en menor medida también en países de todo el mundo. La creciente aparición de cepas de enterococos resistentes a múltiples antibióticos subraya la necesidad de mejorar la comprensión de la patogénesis de la infección (Murray, B.E.N. Engl. J. Med. 2000, 342, 710-721; Theilacker, C., Krueger, W. A., Kropec, A. y Huebner, J. Vaccine 2004, 22 Supl 1, S31-8).

Ácidos teicoicos se pueden encontrar en la pared celular de bacterias gram-positivas tales como estafilococos, estreptococos, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium y Listeria, y parecen sobresalir de la superficie de la capa de peptidoglicano. Ácidos teicoicos no se encuentran en bacterias gram-negativas. Pueden ser unidos covalentemente al ácido N-acetilmurámico de la capa de peptidoglicano (ácido teicoico de la pared, WTA), o unidos a través de un ancla de lípidos en la membrana citoplasmática (ácido lipoteicoico, LTA).

La función principal de los ácidos teicoicos consiste en proporcionar rigidez a la pared celular mediante la atracción de cationes tales como magnesio y sodio. Ácidos teicoicos están habitualmente, pero no siempre, sustituidos con residuos de éster de D-alanina, dando las propiedades de moléculas de iones híbridos. Estos ácidos teicoicos de iones híbridos son sospechosos ligandos para los receptores de tipo Toll 2 y 4. Los ácidos teicoicos también ayudan en la regulación del crecimiento celular mediante la limitación de la capacidad de las autolisinas de romper el enlace (3(1-4) entre la N-acetil glucosamina y el ácido N-acetilmurámico. Los ácidos teicoicos sirven como un sitio de unión para algunos parásitos. La destrucción de las bacterias y la liberación del ácido teicoico en el torrente sanguíneo pueden causar fiebre, dilatación de los vasos sanguíneos y, posiblemente, choque y muerte subsiguiente. El ácido teicoico también puede ser utilizado por las bacterias para adherirse a las membranas de las mucosas.

LTA enterococal es una molécula compleja que consiste en un anclaje de glicolípido y una cadena de fosfato de poliglicerol sustituida de forma no estequiométrica con alanina, kojibiosa, y kojibiosa alaninada (Theilacker, Kaczynski et al. 2006). LTA es un componente integral de la pared celular gram-positiva, y anticuerpos contra este antígeno han demostrado ser protectores contra las infecciones por enterococos (Huebner, Wang et al 1999; Huebner, Quaas et al 2000; Theilacker, Kaczynski et al. 2006). Sin embargo, el componente antigénico que constituye el epítopo protector no se ha definido hasta el momento. Estructuralmente existen moléculas similares en otras bacterias gram-positivas clínicamente relevantes (tales como estreptococos, estafilococos, listeria, etc.) y sueros inmunes de conejo generados contra un LTA de Enterococus faecalis han demostrado ser protectores también contra Streptococcus agalactiae y Staphylococcus aureus (Huebner et al., observación no publicada).

Ácidos teicoicos y ácidos lipoteicoicos se han considerado fuertes pirógenos exógenos, es decir, pertenecen a las sustancias que pueden conducir a una reacción febril en un ser humano después de una infección bacteriana por bacterias gram-positivas. Son muy probablemente reconocidos por el receptor TLR-2 de tipo Toll, que se expresa en monocitos y células dendríticas, linfocitos B y T y macrófagos. Además de ello, conducen a la excreción de

citoquinas y, por lo tanto, son uno de los factores para la reacción inflamatoria después de una infección de este tipo.

Debido a sus propiedades antigénicas, también han sido propuestos como candidatos interesantes para el desarrollo de vacunas sintéticas.

El documento US 7.011.826 describe una vacuna para la prevención de la acidosis láctica en un vertebrado, comprendiendo dicha vacuna al menos un microorganismo aislado, o fragmento o fragmentos del mismo, en donde dicho microorganismo es capaz de producir ácido láctico en el intestino de dicho vertebrado, y en donde dicho microorganismo se selecciona del grupo consistente en: especies tipo Clostridium, especies tipo Prevotella, especies tipo Bacteroides, especies tipo Enterococcus y especies de Selenomonas.

Utilizando la información estructural derivada de los estudios anteriormente mencionados, Hogendorf y colegas recientemente sintetizaron miméticos de la columna vertebral Enterococcus glycerophosphate (Hogendorf, Bos et al. 2010).

Morath et al. (en Morath et al. Synthetic lipoteichoic acid from Staphylococcus aureus is a potent stimulus of cytokine release. J Exp Med. 17 de junio de 2002; 195(12): 1635-1640) describen la síntesis de una molécula de LTA completa con seis unidades de glicerofosfato que portan cuatro sustituyentes alanina más un sustituyente de N- acetil-glucosamina, que exhibía la misma potencia para activar monocitos tal como LTA nativo. Sin embargo, se requirieron concentraciones 100-1.000 veces más altas del anclaje lipídico para la inducción de citoquinas. Se ha de señalar que esta molécula sintética no se desarrolló como agentes terapéuticos, sino para demostrar la hipótesis de que el LTA tiene actividad proinflamatoria. Además de ello, la complejidad de las etapas sintéticas implicadas en la producción de su LTA sintético impide el uso de este material como una vacuna.

Deininger S et al. (en Deininger et al., Use of synthetic derivatives to determine the minimal active structure of cytokine-inducing lipoteichoic acid. Clin Vaccine Immunol. diciembre de 2007; 14(12):1629-1633. Epub 10 de octubre de 2007) describen que la síntesis química de LTA demostró sus propiedades inmunoestimulantes. Para determinar la estructura activa mínima de LTA, redujeron LTA sintético en un cierto número de etapas hacia el anclaje sintético y emplearon estas moléculas para estimular la liberación de interleucina-8 (IL-8) en sangre entera humana. Para inducir la liberación de IL-8 se requerían diez veces más de las estructuras sintéticas con cuatro a seis unidades de poliglicerofosfato (50 nM) sustituido con d-alanina que de la preparación de LTA nativo. Una reducción adicional a tres unidades de la cadena principal con dos residuos de d-alanina o sin ellos dio lugar a la inducción de citoquinas sólo a partir de 500 nM. Cuando se utilizaron los derivados de LTA a 500 nM, éstos indujeron niveles crecientes de IL-8 y factor de necrosis tumoral alfa con un alargamiento creciente de la cadena principal. Una dependencia de TLR2 pudo únicamente observarse con células de ratones deficientes en TLR2 para las dos estructuras sintéticas más grandes. Esto se confirmó mediante el uso de células... [Seguir leyendo]

1. Un mimético sintético de ácido lipoteicoico (LTA) que tiene la siguiente fórmula general (III)

O

O

HO

OGIc

OF^

en donde z es un número entero seleccionado de 1 a 40, y preferiblemente seleccionado de 4 a 6, en donde Ri se selecciona de H o un resto carbohidrato, y

L es un resto enlazador para conectar dicho mimético a una proteína de soporte adecuada, o sales o solvatos del mismo.

2. El mimético sintético de ácido lipoteicoico (LTA) de acuerdo con la reivindicación 1, en donde L se selecciona de un grupo alquilamino que tiene la fórmula general (II)

en donde m es un número entero seleccionado de 1 a 20.

3. El mimético sintético de ácido lipoteicoico (LTA) de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde dicho resto carbohidrato es un resto glucosilo (Glc) seleccionado de una unidad de monosacárido o disacárido tal como glucosa (Glu), glucosamina, A/-acetil glucosamina, galactosa, ramnosa, gentiobiosa o kojibiosa.

4. El mimético sintético de ácido lipoteicoico (LTA) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde L es

5. El mimético sintético de ácido lipoteicoico (LTA) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde z es 5.

6. Una composición farmacéutica, que comprende el mimético de LTA de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y un soporte, adyuvante y/o diluyente farmacéuticamente aceptable.

7. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dicha composición es una vacuna.

8. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, que comprende, además, al menos una citoquina.

9. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en donde dicha vacuna se formula para administración a través de vías intramuscular, subcutánea o por inhalación.

10. La molécula de LTA o la composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para el tratamiento profiláctico o terapéutico de una enfermedad o afección provocada por una bacteria Gram-positiva tal como, por ejemplo, la infección bacteriana, la infección por enterococos, infecciones del tracto urinario, bacteriemia, endocarditis, endocarditis bacteriana, peritonitis, infecciones de heridas y de tejidos blandos y meningitis o neumonía, en donde dicha bacteria Gram-positiva se selecciona preferiblemente de enterococos, estafilococos o estreptococos tal como, por ejemplo, E. faecium, E. faecalis, S. aureus, estafilococos coagulasa negativos o S.

m

(II)

pyogenes, S. pneumoniae, C. diffícile y, en particular, cepas resistentes a antibióticos de los mismos.

11. Un método para producir una molécula de LTA de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende sintetizar dicha molécula sobre un material en fase sólida.

12. Un método para producir un anticuerpo que se une específicamente a una molécula de LTA de acuerdo con 5 cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende inmunizar un animal adecuado con una molécula de LTA de

acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y aislar dicho anticuerpo a partir de dicho animal.

13. La molécula de LTA o la composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o un anticuerpo producido de acuerdo con la reivindicación 12, para uso en el tratamiento profiláctico o terapéutico de una enfermedad o afección provocada por una bacteria.

14. La molécula de LTA o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 13, en donde dicha

enfermedad o afección provocada por una bacteria se selecciona de infección bacteriana, infección por enterococos, infecciones del tracto urinario, bacteriemia, endocarditis bacteriana, peritonitis, infecciones de heridas y de tejidos blandos, y meningitis o neumonía.

15. La molécula de LTA o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 13 ó 14, en donde dicha 15 composición farmacéutica es una vacuna.