Procedimiento de inducción de apoptosis tumoral aumentando los niveles de óxido nítrico.

Procedimiento de identificación de compuestos que inducen apoptosis tumoral mediante inactivación de unacatalasa sobre la superficie de las células tumorales,

que comprende una primera etapa de:

poner en contacto los compuestos de ensayo con células tumorales o células transformadas yseleccionar los compuestos de ensayo que inducen apoptosis, y

una segunda etapa de:

poner en contacto los compuestos de ensayo inductores de la apoptosis identificados en la primera etapacon células en un medio que comprende histidina y seleccionar los compuestos de ensayo que noinducen apoptosis en estas condiciones.

Procedimiento de inducción de apoptosis tumoral aumentando los niveles de óxido nítrico La presente invención se refiere a un procedimiento de inducción de apoptosis tumoral afectando a la vía se señalización de las ROS (especies de oxígeno reactivas) en células tumorales. El incremento del nivel de ROS conduce a la inactivación selectiva de una catalasa de las células tumorales y, como consecuencia, a la apoptosis de estas células. Los niveles de ROS se pueden aumentar incrementando los niveles de óxido nítrico a través de la inhibición de las enzimas óxido nítrico dioxigenasa o arginasa. De acuerdo con la presente invención se pueden usar inhibidores de la óxido nítrico dioxigenasa o arginasa para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer. La presente invención proporciona un procedimiento para identificar compuestos que se pueden usar para el tratamiento del cáncer, en el que el procedimiento permite identificar específicamente compuestos que inducen apoptosis a través de la vía de señalización de ROS. La presente invención también proporciona un kit para identificar compuestos que inducen apoptosis tumoral mediante inactivación de una catalasa sobre la superficie de las células tumorales.

El documento WO 2005/117545 divulga que las vías catabólicas del NO pueden proporcionar resistencia inmunitaria a los carcinomas y, por tanto, sirven como nuevas dianas para la intervención en cáncer. De acuerdo con este documento, se puede influir sobre las vías catabólicas del NO usando inhibidores de la óxido nítrico dioxigenasa en una cantidad suficiente para aumentar la concentración intracelular del óxido nítrico (NO) . No obstante, el documento WO 2005/117545 no divulga la apoptosis selectiva de las células tumorales destruyendo la catalasa de las células tumorales y mediando en la vía de señalización de ROS. La presente invención no se basa en un efecto inmunológico de los inhibidores de la óxido nítrico dioxigenasa sino en la destrucción selectiva de células tumorales.

El documento WO 2005/000208 se refiere al uso de una combinación de un inhibidor de la HMG-CoA reductasa y un azol para el tratamiento de una neoplasia maligna. El uso de una combinación de los dos compuestos se basó en el hallazgo del descubrimiento de que los azoles potencian la actividad antiproliferativa de los inhibidores de la HMG-CoA reductasa contra las células cancerosas in vitro.

Además, el documento WO 2004/073623 se refiere a un procedimiento de tratar a un sujeto que tiene niveles elevados de arginasa como síntoma o causa de un trastorno. Dicho tratamiento comprende administrar un inhibidor de la arginasa con el fin de potenciar la biodisponibilidad de la arginina en el sujeto. No obstante, no existen enseñanzas en este documento sobre que los inhibidores de la arginasa se pueden usar para destruir la catalasa de las células tumorales e inducen una apoptosis celular selectiva de las células tumorales.

El documento WO 03/03990 se refiere al uso de un compuesto que disminuye la producción de una proteína implicada en el metabolismo de la arginina en la preparación de un medicamento para tratar asma o alergias. Cualquier efecto de los inhibidores de arginasa sobre la catalasa de las células tumorales o sobre la vía de señalización de ROSA no se describe en este documento.

Buga et al. (Am. J. Physiol., 1989, páginas 1256-1264) describen el uso de NG-hidroxi-L-arginina (NOHA) para inhibir a proliferación de las células tumorales Caco-2. El efecto de los inhibidores de arginasa sobre la apoptosis selectiva de las células tumorales como se usa en la presente invención no está indicado en dicho documento.

El documento WO 97/05873 también divulga el uso de fluconazol (un inhibidor de la óxido nítrico dioxigenasa) para la inhibición del crecimiento de células tumorales debido a las propiedades del fluconazol para potenciar el efecto de un agente quimoterapéutico. De un modo similar, el documento US5.565.478 se refiere al aumento de la actividad de paclitaxel por ketoconazol cuando se usa para el tratamiento del cáncer.

El documento US 5 795 790 se refiere a procedimientos y composiciones para controlar la distribución celular dentro de un órgano bioartificial exponiendo las células a un tratamiento que inhibe la proliferación celular, estimula la diferenciación celular o efectúa las uniones celulares a una superficie de crecimiento dentro del órgano bioartificial. Los estudios experimentales se llevaron a cabo en células BHK (de riñón de hámster neonato) . Además, en la presente publicación no se nombra a la histidina y, por tanto, no se describe ninguna función de la propia histidina.

Franek et al., Immunology letters (1996) , 139-144 enseña que las células de hibridoma al borde de apoptosis inducida por inanición podrían rescatarse mediante varios aminoácidos (incluyendo histidina) que se han añadido de forma individual. No se divulga una descripción concreta del modo en el que funciona el efecto de prevención de la apoptosis.

En Franek et al., Archives of Biochem. Biophys. (2002) , 141-146, se estudia la actividad antiapoptótica sobre células de hibridoma en las que la apoptosis se induce por inanición. Se ha sugerido que los aminoácidos que evitan la apoptosis actúan como moléculas señal en lugar de los nutrientes y que la señal tenía un carácter de factor de supervivencia.

El documento US5.565, 478 se refiere al tratamiento del cáncer, más precisamente a composiciones y procedimientos para la inhibición del crecimiento de células cancerosas de ovario humano. Las composiciones divulgadas, que son, por ejemplo, combinaciones de azoles y derivados de taxano proporcionan efectos

anticancerosos potenciados. No obstante, el documento no menciona nada sobre la apoptosis de las células tumorales. Los denominados efectos anticancerosos potenciados son, obviamente, solo efectos de inhibición sobre el crecimiento de células cancerosas.

Además, el documento DE 199 63 052 divulga el uso de azoles para la prevención del cáncer de piel mediado por radiación UV. Ninguno de los documentos anteriores divulga una apoptosis selectiva de células tumorales. Especialmente, no hay enseñanzas sobre el uso de una combinación de un inhibidor de la óxido nítrico dioxigenasa y un inhibidor de la arginasa para el tratamiento del cáncer.

También se sabe por el trabajo experimental de Irani et al. (Science 1997; 275:1649-1652) que la transformación oncogénica de las células produce la generación constitutiva de aniones superóxido extracelulares a través de una NADPH oxidasa asociada a la membrana. A continuación, las células tumorales se distinguen de las células transformadas. Las células transformadas se pueden definir como células que se ha transformado in vitro, bien mediante la expresión de oncogenes específicos, mediante cambios carcinogénicos químicos o físicos o transformación espontánea, y poseen potencial para la formación tumoral. Las células tumorales, así como las células transformadas, producen aniones superóxido extracelulares. Los aniones superóxido reaccionan al peróxido de hidrógeno en una distancia cercana a la superficie celular. El peróxido de hidrógeno es duradero y extenso, pero, no obstante, mucho más reactivo que los aniones superóxido. Por ejemplo, los aniones superóxido no inducen la apoptosis directamente, pero el peróxido de hidrógeno sí lo hace si se alcanza una concentración determinada.

Además, de Engelmann y Bauer (Anticancer Research 2000; 20:2297-2306) se sabe que los fibroblastos no transformados, que se han estimulado con TGF (factor de crecimiento transformante ) -beta o FGF (factor de crecimiento de fibroblastos) , pueden servir como células efectoras intercelulares e inducir la apoptosis en las células transformadas. Los fibroblastos no transformados no están dañados.

Por De Bauer et al. (Prostaglandines, Leukotrienes and Essential Fatty Acids 2002; 66:41-56) se conoce que las células transformadas liberan aniones superóxido, que exhiben funciones de señalización tales como la regulación de la proliferación y el mantenimiento del estado transformado. El producto de la dismutación, peróxido de hidrógeno, regula los niveles intracelulares de la catalasa cuya actividad se ha observado que está regulada por aumento en determinadas células transformadas. Después de la depleción del glutatión, las especies de oxígeno reactivas (ROS) derivadas de células transformadas exhiben potencial inductor de la apoptosis mediante la reacción de Haber-Weiss catalizada con metal, que convierte el peróxido de hidrógeno en la forma del radical hidroxilo altamente reactiva, de vida extremadamente corta y de corto alcance.

1. Procedimiento de identificación de compuestos que inducen apoptosis tumoral mediante inactivación de una catalasa sobre la superficie de las células tumorales, que comprende una primera etapa de:

poner en contacto los compuestos de ensayo con células tumorales o células transformadas y 5 seleccionar los compuestos de ensayo que inducen apoptosis, y

una segunda etapa de:

poner en contacto los compuestos de ensayo inductores de la apoptosis identificados en la primera etapa con células en un medio que comprende histidina y seleccionar los compuestos de ensayo que no inducen apoptosis en estas condiciones.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la primera etapa comprende suministrar TGF-a las células.

3. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en el que el procedimiento se puede realizar sin células no tumorales o células no transformadas.

4. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que además comprende la 15 etapa de determinar si los compuestos son tóxicos para las células no tumorales.

5. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que además comprende la etapa de determinar si la inhibición de la apoptosis tumoral por la histidina está basado en la señalización de ROS (especie de oxígeno reactiva) .

6. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa de

analizar el efecto sobre la señalización de ROS se realiza poniendo en contacto los compuestos de ensayo con las células tumorales y suministrando un compuesto, que es capaz de disminuir el nivel de un compuesto seleccionado del grupo que consiste en: aniones superóxido, peróxido de hidrógeno, peroxidasa, HOCl, radical hidroxilo, óxido nítrico, radical hidroxilo, peroxinitrito, y en el que la disminución del nivel de este compuesto reduce el efecto de la apoptosis tumoral inducida por el compuesto de ensayo.

7. Kit para identificar compuestos de acuerdo con el procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1-6, que induce apoptosis tumoral inactivando una catalasa sobre la superficie de las células tumorales, que comprende células tumorales, TGF-beta, histidina y un compuesto que es capaz de disminuir los niveles de un compuesto seleccionado del grupo que consiste en: aniones superóxido, taurina, óxido nítrico, radical hidroxilo, peróxido de hidrógeno, peroxinitrito.

8. Composición de un inhibidor de la óxido nítrico dioxigenasa y un inhibidor de la arginasa para su uso en el tratamiento del cáncer, en la que el inhibidor de la óxido nítrico dioxigenasa reduce la actividad enzimática para catalizar la formación de nitrato a partir de óxido nítrico, y en la que el inhibidor de la arginasa reduce la actividad enzimática para catalizar la formación de citrulina a partir de arginina,

9. La composición de acuerdo con la reivindicación 8 para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en la que el inhibidor de óxido nítrico dioxigenasa es seleccionado del grupo que consiste en: itraconazol, fluconazol, econazol, bifonazol, ketoconazol, sulconazol y miconazol.

10. La composición de acuerdo con la reivindicación 8 o 9 para su uso de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, en la que el inhibidor de la óxido nítrico dioxigenasa es itraconazol.

11. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-10 para su uso de acuerdo con una

cualquiera de las reivindicaciones 8-10, en la que el inhibidor de la arginasa se selecciona del grupo que consiste en (S) - (2-boronoetil) -L-cisteína (BEC) , ácido 2 (S) -amino-6-boronohexanoico (ABHA) , NOHA/ L-HO-Arg (NG-hidroxi-L-arginina) , nor-NOHA/ ácido L-2-amino- (4- (2'hidroxiguanidino) butírico (Nomega-hidroxi-nor-Larginina) y DL-alfa-difluorometilornitina (DFMO) .

12. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-10 para su uso de acuerdo con una 45 cualquiera de las reivindicaciones 8-10, en la que el medicamento comprende además taxol.

13. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-10 para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-10, en la que la proporción molar entre inhibidor de la óxido nítrico dioxigenasa / arginasa está entre 10:1 y 1:10.