Un método para liberar virus de células animales que contienen dichos virus,

que comprende someter las células a centrifugación continua en condiciones eficaces para concentrar las células en un pelet de células, y expulsar de la centrífuga las células reducidas a un pelet por aberturas de salida de expulsión a un receptáculo de recogida, en condiciones tales que las células se someten a fuerzas eficaces para lisar dichas células, en el cual no se realiza paso adicional alguno eficaz para llevar a cabo la lisis celular

Concentración y lisis de células infectadas por adenovirus en una sola operación unitaria.

Campo de la invención

Esta invención describe, v.g. un método para preparar virus (v.g., Adenovirus) u otros organismos intracelulares.

Descripción de la invención

Esta invención describe, v.g. un método para liberar (preparar) entidades biológicas intracelulares (v.g., organismos, tales como, v.g., virus o partículas de virus, particularmente Adenovirus; orgánulos; o moléculas biológicas), que comprende someter células que contienen dichas entidades biológicas a un procedimiento continuo de centrifugación tal que, después de la concentración de las células a un sedimento de células y expulsión subsiguiente de la centrífuga, las células están lisadas suficientemente para permitir la preparación de un alto rendimiento (por célula del material de entrada) de las entidades biológicas. No se realiza ningún paso adicional eficaz para conseguir la lisis celular (v.g., un paso de congelación-descongelación o microfluidización) después de la expulsión del sedimento de células de la centrífuga. En una realización preferida, los organismos así preparados retienen un alto grado de viabilidad y/o infectividad; y las entidades tales como orgánulos o moléculas biológicas están sustancialmente intactas y/o son biológicamente activas.

Una ventaja del método es que permite concentrar y lisar células en un solo paso de proceso, simplificando y reduciendo con ello el coste del aislamiento de entidades biológicas intracelulares (v.g., subcelulares) a partir de las células. Otra ventaja del método es que puede obtenerse un rendimiento de material intracelular biológicamente activo mayor que con otros métodos. Otra ventaja del método es que permite una lisis suave de las células, de tal modo que las entidades biológicas intracelulares, v.g., virus, se mantienen sustancialmente intactas y/o viables durante el procedimiento de lisis.

Una realización de la invención es un método para preparar organismos intracelulares a partir de células hospedadoras que contienen dichos organismos, que comprende someter las células a centrifugación continua en condiciones eficaces para concentrar las células en un sedimento de células; y expulsar de la centrífuga las células reducidas a un sedimento a un receptáculo de recogida, en condiciones eficaces para lisar las células; en el cual no se realiza paso alguno eficaz para conseguir la lisis celular.

Las células en el "expulsado" (las células expulsadas) están lisadas sustancialmente y/o lisadas predominantemente; al menos 50%, preferiblemente al menos 90%, de las células están lisadas; las células se lisan a medida que se expulsan; los organismos intracelulares son virus; los virus son adenovirus; los adenovirus son adenovirus recombinantes adecuados para terapia génica; el rendimiento/célula de partículas de adenovirus o adenovirus infeccioso es mayor que el que puede obtenerse cuando las células que contienen dicho adenovirus se lisan por un procedimiento de congelación-descongelación, v.g., el rendimiento/célula de partículas de adenovirus es aproximadamente 1,2 a aproximadamente 1,6 veces mayor, o el rendimiento/célula de adenovirus infeccioso es aproximadamente 1,5 a aproximadamente 1,9 veces mayor; las células son células animales, preferiblemente células de mamífero o de insecto; las células expulsadas se hallan bajo una fuerza centrífuga relativa de aproximadamente 6.500 a 10.000 g, con preferencia aproximadamente 7.000 a 9.000 g; siendo dicha fuerza centrífuga aproximadamente 7.000 u 8.000 g; las células reducidas a un sedimento se expulsan a través de una o más salidas de expulsión que tienen una forma rectangular y un área de sección transversal de aproximadamente 50 a 500 mm²; las células se centrifugan en una centrífuga Westfalia, Modelo CSA-1 o CSC-6; o las fuerzas ejercidas sobre las células en el momento de la expulsión son eficaces para lisar sustancialmente las células.

Otra realización se refiere a un método de preparación de virus intracelulares a partir de células que contienen dichos virus por centrifugación continua, comprendiendo la mejora cosechar los virus a partir del sedimento de células expulsado directamente, sin realizar ningún paso adicional eficaz para conseguir la lisis celular.

Otra realización es un método para preparar un lisado de células, que comprende someter las células a centrifugación continua en condiciones eficaces para concentrar las células en un sedimento de células; y expulsar de la centrífuga las células reducidas a un sedimento enviándolas a un receptáculo de recogida, en el cual las células se encuentran en la forma de un lisado de células; en donde no se realiza paso eficaz alguno adicional para conseguir la lisis celular.

Otra realización es un método para preparar un orgánulo o molécula biológica, que comprende someter células que contienen dicho orgánulo o molécula biológica a centrifugación continua en condiciones eficaces para concentrar las células en un sedimento de células; expulsar de la centrífuga las células reducidas a un sedimento a un receptáculo de recogida, en el cual las células contenidas en el "expulsado" (las células expulsadas) están sustancialmente lisadas; en donde no se realiza paso eficaz adicional alguno para conseguir la lisis celular; y cosechar el orgánulo o la molécula biológica del expulsado.

En el método de la invención, un cultivo de células que comprende una entidad biológica (v.g., un organismo, orgánulo o material biológico) de interés se alimenta a través de una centrífuga continua. Típicamente, un "sedimento de células" concentrado (que, por supuesto, puede comprender porciones de células o residuos de células, además de células intactas) se recoge en un recipiente de centrífuga (v.g., un bol), mientras que el medio agotado se retira continuamente a través de una primera salida a un primer recipiente de recogida. A intervalos de tiempo predeterminados, se inicia opcionalmente una alimentación de tampón de lavado (cualquier tampón de lavado adecuado, v.g., tampón de congelación PBS) a fin de intercambiar cualquier sobrenadante que quede en el recipiente de centrífuga con el tampón de lavado. A continuación de este intercambio (si se emplea), la alimentación de tampón de lavado se interrumpe y las células concentradas se expulsan del recipiente de la centrífuga a través de una segunda salida a un segundo receptáculo de recogida. Dependiendo del volumen en el cual se expulsan las células, la concentración de células puede ser significativamente mayor que la concentración inicial en la alimentación (v.g., aproximadamente una concentración de 10 veces a 50 veces mayor, típicamente del orden de 30 veces).

Sin desear quedar ligados a teoría alguna, se propone que las células se mantienen sustancialmente intactas cuando se centrifugan para dar el pelet de células. Es decir, una fracción suficientemente pequeña de células se lisa durante la centrifugación de tal modo que una cantidad significativa de organismos intracelulares, orgánulos, o moléculas biológicas no se libera prematuramente en el sobrenadante y se desvía al receptáculo de recogida con el medio agotado. Las condiciones de centrifugación pueden optimizarse rutinariamente para cualquier célula de interés a fin de minimizar la cantidad de lisis celular durante la centrifugación. Véanse, v.g., los Ejemplos 2 y 4 para condiciones típicas de centrifugación.

Se propone también que a medida que las células concentradas (peletizadas) son expulsadas luego de la centrífuga a través de una salida de expulsión, se ven sometidas a fuerzas (v.g., fuerzas de cizallamiento), tales que las células se lisan sustancialmente. Una diversidad de medios de expulsión por los cuales las células son expulsadas a través de una salida de expulsión están abarcados por la invención. En general, las células son forzadas fuera de (expulsadas de) la centrífuga por fuerza centrífuga a través de una salida de expulsión cuando se retira una barrera (v.g., una puerta) (v.g., se levanta o se desplaza), en un momento oportuno, dejando abierta la salida de expulsión. Tales barreras pueden ser accionadas por cualquiera de una diversidad de mecanismos, v.g., electrónicos (v.g. de solenoide), neumáticos, magnéticos o mediante un acoplamiento mecánico. En una realización preferida, una puerta es abierta por una transmisión accionada hidráulicamente, utilizando agua que no está en contacto con las...

1. Un método para liberar virus de células animales que contienen dichos virus, que comprende

someter las células a centrifugación continua en condiciones eficaces para concentrar las células en un pelet de células, y

expulsar de la centrífuga las células reducidas a un pelet por aberturas de salida de expulsión a un receptáculo de recogida, en condiciones tales que las células se someten a fuerzas eficaces para lisar dichas células, en el cual no se realiza paso adicional alguno eficaz para llevar a cabo la lisis celular.

2. El método de la reivindicación 1, en el cual más del 85% de las células se lisan.

3. El método de la reivindicación 1, en el cual más del 50% de las células se lisan.

4. El método de la reivindicación 1, en el cual los virus son Adenovirus.

5. El método de la reivindicación 4, en el cual los Adenovirus son Adenovirus recombinantes adecuados para terapia génica.

6. El método de la reivindicación 4, en el cual el rendimiento/célula de partículas de Adenovirus o Adenovirus infecciosos es mayor que el que puede obtenerse cuando las células que contienen dicho Adenovirus se lisan por un procedimiento de congelación-descongelación.

7. El método de la reivindicación 6, en el cual el rendimiento/célula de partículas de Adenovirus es 1,2 a 1,6 veces mayor que el obtenible cuando las células que contienen dicho Adenovirus se lisan por un procedimiento de congelación-descongelación.

8. El método de la reivindicación 6, en el cual el rendimiento/célula de Adenovirus infecciosos es 1,5 a 1,9 veces mayor que el obtenible cuando las células que contienen dicho Adenovirus se lisan por un procedimiento de congelación-descongelación.

9. El método de la reivindicación 1, en el cual las células son células de mamífero o de insecto.

10. El método de la reivindicación 1, en el cual las células que se expulsan se someten a una fuerza centrífuga relativa de 6.500 a 7.500 g.

11. El método de la reivindicación 10, en el cual dicha fuerza centrífuga es 7.000 g.

12. El método de la reivindicación 1 ó 10, en el cual las células reducidas a un pelet se expulsan a través de una o más salidas de expulsión que tienen una forma rectangular y un área de sección transversal de 50 a 500 mm².

13. El método de la reivindicación 1, en el cual las células se centrifugan en una centrífuga Westfalia, modelo CSA-1 o CSC-6.

14. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente someter las células expulsadas a cromatografía en lecho expandido.

15. Un método para preparar un lisado de células, que comprende

someter células animales a centrifugación continua en condiciones eficaces para completar las células en un pelet de células, y

expulsar de la centrífuga las células reducidas a un pelet a través de aberturas de salida de expulsión a un receptáculo de recogida, en condiciones tales que las células se someten a fuerzas eficaces para lisar dichas células, en el cual no se realiza paso adicional alguno eficaz para llevar a cabo la lisis celular.

16. El método de la reivindicación 15, que consiste en

someter células animales a centrifugación continua a fin de formar un pelet de células, y expulsar de la centrífuga dichas células reducidas a un pelet a través de aberturas de salida de expulsión a un receptáculo de recogida en condiciones tales que las células se someten a fuerzas eficaces para lisar dichas células.

17. Un método para preparar un organismo intracelular, o un orgánulo intracelular o molécula biológica, a partir de células hospedadoras animales que contienen dicho organismo, orgánulo o molécula, que comprende

someter las células a centrifugación continua en condiciones eficaces para concentrar las células en un pelet de células, y

expulsar de la centrífuga las células reducidas a un pelet a través de aberturas de salida de expulsión a un receptáculo de recogida, en condiciones tales que las células se someten a fuerzas eficaces para lisar dichas células, en el cual no se realiza paso adicional alguno eficaz para llevar a cabo la lisis celular.