INDUCTOR DE LA RESPUESTA HIPERSENSIBLE EN PLANTAS.

Una molécula de ADN aislada que codifica un polipéptido que induce una respuesta hipersensible en diferentes especies de plantas cuando dicho polipéptido es introducido en el tejido de una planta,

en el que el polipéptido que induce la respuesta hipersensible procede del patógeno Erwinia, comprendiendo dicha molécula de ADN una secuencia de ácido nucleico que puede hibridarse, en condiciones rigurosas de lavado de 0,4 x SSG, SDS al 0,2% a 65ºC, con un fragmento de HindIII de 1,3 kb presente en el plásmido pCPP1084 de la ATCC con el número de depósito 69021

Las plantas así como los seres humanos y los animales, sufren lesiones y pérdidas producidas por infecciones por bacterias. A escala mundial, las bacterias clasificadas en los géneros Erwinia, Pseudomonas y Xanthomonas son responsables de la mayoría de las pérdidas producidas por fitopatógenos bacterianos. Muchas de las enfermedades bacterianas de las plantas provocan, de forma esporádica, grandes pérdidas a los agricultores. Las pérdidas son resultado de muerte, deformidad o productividad reducida de las plantas afectadas.

Muchos fitopatógenos bacterianos presentan un marcado grado de especificidad hacia las plantas que infectan. Por ejemplo, Erwinia amylovora infecta manzano, perales y plantas relacionadas con la familia Rosaceae. Otras plantas no enferman cuando se exponen a E. amylovora. Sin embargo, cuando se introducen células suficientes de E. amylovora en el tejido de las hojas de las otras plantas, el tejido mesófilo se colapsa pasadas unas horas. Este colapso ha recibido el nombre de respuesta hipersensible (RH), y se considera una reacción de defensa de las plantas dado que, durante la RH, las bacterias están delimitadas al interior del tejido colapsado, muriendo eventualmente y por lo tanto no causan daños a toda la planta.

Los genes que requieren los fitopatógenos bacterianos para poder inducir la RH, denominados genes hrp, por reacción hipersensible y patogenicidad, también son necesarios para provocar la enfermedad. Sin embargo, los productos de genes hrp y cómo funcionan en la inducción de la RH y en el desarrollo de la enfermedad, se desconocían antes de la presente invención. La presente invención se refiere a productos de genes hrp (inductores) responsables del colapso observado en la RH y que son necesarios para el desarrollo de la enfermedad.

Las interacciones entre los patógenos bacterianos y sus plantas huéspedes generalmente pertenecen a dos categorías: (1) compatible (patógeno-huésped), que conduce al crecimiento bacteriano intercelular, al desarrollo de los síntomas y al desarrollo de la enfermedad en la planta huésped; y (2) incompatible (patógeno-no-huésped), que tiene como resultado la respuesta hipersensible, un tipo particular de interacción incompatible, sin síntomas progresivos de la enfermedad. Durante las interacciones compatibles en plantas huésped, las poblaciones bacterianas aumentan drásticamente y se producen síntomas progresivos; durante las interacciones incompatibles las poblaciones bacterianas no aumentan y no se producen síntomas progresivos.

La respuesta hipersensible de las plantas superiores se caracteriza por el colapso y muerte rápidos y localizados de los tejidos que contienen un patógeno incompatible (un microorganismo que solo es patógeno en otras plantas) y está asociada con la defensa de las plantas contra muchas bacterias, hongos, nematodos y virus [véase Phytopathogenic Prokaryotes, (M.S. Mount and G.H. Lacy eds.) Academic Press, New York. págs. 149-177 (1982)]. En 1963 se demostró por primera vez la inducción de la respuesta hipersensible por bacterias cuando se infiltraron los espacios intercelulares de hojas de tabaco con 107 células/ml de un patógeno incompatible. Las áreas infiltradas se colapsaron en 24-48 horas y dejaron de favorecer la multiplicación bacteriana (véase Nature 199: 299 (1963)]. Por tanto, en la RH, se localiza el patógeno y se limita su posterior crecimiento.

La técnica usada en el laboratorio para demostrar la RH es directa. Se infiltran los espacios intercelulares de hojas de tabaco puncionando en primer lugar un sector de una hoja con una aguja de disección recta normal. A continuación, se aplica una jeringa de 1 ml de capacidad (sin aguja), que contiene 0,1-0,5 ml de una suspensión de células bacterianas (normalmente 107-108 células viables/ml) de la bacteria en uno de los laterales de la hoja, directamente sobre la punción. Mientras se presiona con un dedo en el lado opuesto de la hoja para estabilizarla y para evitar que el líquido se escape del área puncionada, se presiona ligeramente el émbolo de la jeringa para introducir la suspensión bacteriana en la hoja. La infiltración se considera satisfactoria cuando en la hoja aparece un área empapada de aproximadamente 1-4 cm2.

Una hipótesis común propuesta para explicar el mecanismo de inducción de la reacción hipersensible implica la producción de un inductor específico por parte de las bacterias que reacciona con un receptor específico de las células de la planta. Sin embargo, la base molecular (genes y producto de genes) de esta respuesta hacia patógenos potenciales era desconocida antes de la presente invención a pesar de la investigación continuada realizada por fitopatólogos desde que se describió por primera vez la RH en 1963.

Las observaciones fisiológicas y genéticas sugieren que el mismo factor bacteriano que induce la respuesta hipersensible en no-huésped también es necesario para la patogenicidad en huéspedes.

La producción del inductor de la respuesta hipersensible está controlada por un conjunto de diversos genes hrp, que están muy conservados y que a menudo son intercambiables, entre muchas especies de bacterias fitopatógenas. Aunque otros investigadores han clonado varios genes hrp e individuales, se han clonado grupos funcionales de genes hrp solo a partir de Erwina amylovora y Pseudomonas syringae. Se ha demostrado que estos grupos confieren a bacterias no patógenas la capacidad de inducir la respuesta hipersensible en hojas de tabaco y en hojas de otro tipo [véase Mol. Plant-Microbe Interact. 4:132 (1991): J. Bacteriol 170:4748 (1988); y Beer y col., Advances in Molecular Genetics of Plant-Microbe Interactions (H. Hennecke and D.P.S. Verma eds.) Kluwer Academic Publishers, Boston, págs. 53-60 (1991)].

De acuerdo con la presente invención se proporciona una molécula de ADN aislada que codifica a un polipéptido que induce una respuesta hipersensible en diferentes especies de plantas cuando dicho polipéptido se introduce en el tejido de una planta, en el que el polipéptido inductor de la respuesta hipersensible procede de un patógeno Erwinia, comprendiendo dicha molécula de ADN una secuencia de ácido nucleico que puede hibridarse en condiciones rigurosas de lavado, 0,4 x SSC, SDS al 2% a 65ºC, con un fragmento HindIII de 1,3 kb presente en el plásmido pCPP1084 procedente de la ATCC Depósito 69021.

Preferentemente, el polipéptido que la molécula de ADN codifica, puede inducir una respuesta hipersensible en diferentes especies de plantas cuando dicho polipéptido se introduce en el tejido de la hoja de una planta en condiciones de crecimiento normales.

Preferentemente, el polipéptido codificado pertenece a un inductor de respuesta hipersensible de un patógeno de Erwinia, Pseudomonas o Xanthomonas.

Preferentemente, el polipéptido codificado se caracteriza por una capacidad para inducir una respuesta hipersensible en tejidos de plantas, estabilidad térmica, un alto contenido en glicinas y sustancialmente sin cisteína.

De acuerdo con la presente invención también se proporciona un gen aislado que comprende la molécula de ADN de acuerdo con la presente invención.

De acuerdo con la presente invención también se proporciona una célula huésped que tiene un vector que comprende la molécula de ADN de acuerdo con la presente invención.

De acuerdo con la presente invención también se proporciona un polipéptido aislado codificado por la molécula de ADN de la presente invención. Preferentemente, el polipéptido está purificado o es recombinante.

Inicialmente, se aisló y purificó el inductor de la respuesta hipersensible a partir de E. coli DH5α(pCPP430) y posteriormente de una cepa natural de E. amylovora, la bacteria que provoca una enfermedad en las plantas rosáceas, tales como el manzano y el peral, conocida como fuego bacteriano. Se propone el nombre “harpin” para el inductor de la respuesta hipersensible de E. amylovora; se considera que este inductor pertenece al arquetipo de una familia de inductores proteicos de la RH producidos por diferentes bacterias fitopatógenas.

Por tanto, un aspecto de la presente invención es describir proteínas inductoras específicas aisladas de bacterias, que cuando se aplican en plantas no huésped, provocan una respuesta tóxica similar a la respuesta inducida por las células vivas de las bacterias que producen las proteínas. Otro aspecto de la presente invención es el aislamiento y descripción de los genes que codifican las proteínas inductoras, que pueden usarse... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ADN aislada que codifica un polipéptido que induce una respuesta hipersensible en diferentes especies de plantas cuando dicho polipéptido es introducido en el tejido de una planta, en el que el polipéptido que induce la respuesta hipersensible procede del patógeno Erwinia, comprendiendo dicha molécula de ADN una secuencia de ácido nucleico que puede hibridarse, en condiciones rigurosas de lavado de 0,4 x SSG, SDS al 0,2% a 65ºC, con un fragmento de HindIII de 1,3 kb presente en el plásmido pCPP1084 de la ATCC con el número de depósito 69021.

2. La molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la molécula de ADN que codifica el polipéptido

puede inducir una respuesta hipersensible en diferentes especies de plantas cuando dicho polipéptido es introducido 10 en el tejido de la hoja de una planta en condiciones de crecimiento normales.

3. La molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en la que el polipéptido codificado corresponde a un inductor de respuesta hipersensible de un patógeno Erwinia, Pseudomonas o Xanthomonas.

4. La molécula de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el polipéptido

codificado se caracteriza por una capacidad de inducir una respuesta hipersensible en tejidos de plantas, 15 estabilidad térmica, un alto contenido en glicinas y sustancialmente sin cisteína.

5. Un gen aislado que comprende la molécula de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

6. Una célula huésped que tiene un vector que comprende la molécula de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

7. Un polipéptido aislado codificado por la molécula de ADN de cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

20 8. El polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el polipéptido está purificado o es recombinante.