Sobreexpresión de genes de fitasa en sistemas de levadura.

Un método de producción de fitasa en levadura que comprende: proporcionar un gen appA aislado a partir de células bacterianas,

codificando dicho gen appA una proteína o polipéptido con actividad fitasa, expresar dicho gen appA en una cepa de levadura, y aislar la proteína o polipéptido expresado, teniendo dicha proteína o polipéptido una termoestabilidad aumentada en comparación con la de dicha proteína o polipéptido expresado en una célula hospedadora no de levadura.

Sobreexpresión de genes de fitasa en sistemas de levadura Campo de la invención La presente invención se refiere a un método de producción de fitasa en levadura, a cepas de levadura que expresan fitasa heteróloga y a la fitasa heteróloga producida por levadura.

Antecedentes de la invención Las fitasas, un grupo específico de monoéster fosfatasas, son necesarias para iniciar la liberación de fosfato (“P”) a partir de fitato (hexafosfato de mioinositol) , la forma de almacenamiento principal del P en alimentos o piensos cereales (Reddy, N.R. et al., “Phytates in Legumes and Cereals”, Advances in Food Research, 28: 1 (1982) ) . Debido a que los animales con un solo estómago como cerdos y aves de corral, así como seres humanos, tienen poca actividad fitasa en sus tractos gastrointestinales, casi todo el P de fitato ingerido es indigerible. Esto da como resultado la necesidad de suplementar con P inorgánico, un nutriente costoso y no renovable, las dietas para estos animales. Más indeseablemente, el P de fitato inutilizado excretado a través del abono de estos animales se convierte en contaminación por P del ambiente (Cromwell, G.L. et al., “P – A Key Essential Nutrient, Yet a Possible Major Pollutant- Its Central Role in Animal Nutrition”, Biotechnology in the Feed Industr y ; Proceedings Alltech 7th Annual Symposium, pág. 133 (1991) ) . Además, el fitato quela oligoelementos esenciales como cinc y produce deficiencias de nutrientes tales como retardo de crecimiento y mental en niños que ingieren principalmente alimentos de origen vegetal sin eliminación de fitato.

Se han clonado y secuenciado dos fitasas, phyA y phyB, a partir de NRRL3135 de Aspergillus niger (Ehrlich, K.C. et al., “Identification and Cloning of a Second Phytase Gene (phys) from Aspergillus niger (ficuum) ”, Biochem. Biophys. Res. Commun., 195: 53-57 (1993) ; Piddington, C.S. et al., “The Cloning and Sequencing of the Genes Encoding Phytase (phy) and pH 2.5-optimum Acid Phosphatase (aph) from Aspergillus niger var. awamori”, Gene, 133: 56-62 (1993) ) . Recientemente, se han aislado nuevos genes de fitasa a partir de Aspergillus terreus y Myceliophthora thermophila (Mitchell et al., “The Phytase Subfamily of Histidine Acid Phosphatases: Isolation of Genes for Two Novel Phytases From the Fungi Aspergillus terreus and Myceliophthora thermophila”, Microbiology, 143: 245-252, (1997) ) , Aspergillus fumicatus (Pasamontes et al., “Gene Cloning, Purification, and Characterization of a Heat-Stable Phytase from the Fungus Aspergillus fumigatus”, Appl. Environ. Microbiol., 63: 1696-1700 (1997) ) , Emericella nidulans y Talaromyces thermophilus (Pasamontes et al., “Cloning of the Phytase from Emericella nidulans and the Thermophilic Fungus Talaromyces thermophilus”, Biochim. Biophys. Acta., 1353: 217-223 (1997) ) , y maíz (Maugenest et al., “Cloning and Characterization of a cDNA Encoding a Maize Seedling Phytase”, Biochem. J., 322: 511-517 (1997) ) .

Se han aislado y/o purificado diversos tipos de enzimas fitasa a partir de Enterobacter sp. 4 (Yoon et al., “Isolation and Identification of Phytase-Producing Bacterium, Enterobacter sp. 4, and Enzymatic Properties of Phytase Enzyme”, Enzyme and Microbial Technology 18: 449-454 (1996) ) , Klebsiella terrigena (Greiner et al., “Purificacion and Characterization of a Phytase from Klebsiella terrigena”, Arch. Biochem. Biophys. 341: 201-206 (1997) ) , y Bacillus sp. DS11 (Kim et al., “Purification and Properties of a Thermostable Phytase from Bacillus sp. DS11”, Enzyme and Microbial Technology 22: 2-7 (1998) ) . Se han estudiado las propiedades de estas enzimas. Además, se ha reseñado la estructura cristalina de phyA de Aspergillus ficuum (Kostrewa et al., “Cr y stal Structure of Phytase from Aspergillus ficuum at 2.5 A Resolution”, Nature Structure Biology 4: 185-190 (1997) ) . Greiner et al, Arch. of Biochemistr y and Biophysics 303, pp. 107-113, 1993 divulga la purificación y caracterización de dos fitasas de E. coli, una de las cuales supuestamente tiene propiedades químicas y cinéticas similares a una fosfatasa ácida a pH 2, 5 caracterizada por Dassa et al., J. Biol. Chyem. 257, pp. 6669-6676, 1982.

Hartingsveldt et al. introdujeron el gen phyA en A. niger y obtuvieron un aumento de diez veces de la actividad fitasa, en comparación con el tipo silvestre (“Cloning, Characterization and Overexpression of the Phytase-Encoding Gene (phyA) of Aspergillus niger”, Gene 127: 87-94 (1993) ) . Se ha mostrado que la fitasa microbiana suplementaria de esta fuente en las dietas para cerdos y aves de corral es eficaz en la mejora de la utilización de P de fitato y cinc (Simons et al., “Improvement of Phosphorous Availability By Microbial Phytase in Broilers and Pigs”, Br. J. Nutr., 64: 525 (1990) ; Lei, X.G. et al., “Supplementing Corn-Soybean Meal Diets With Microbial Phytase Linearly Improves Phytate P Utilization by Weaning Pigs”, J. Anim. Sci., 71: 3359 (1993) ; Lei, X.G. et al., “Supplementing Corn-Soybean Meal Diets With Microbial Phytase Maximizes Phytate P Utilization by Weaning Pigs”, J. Anim. Sci., 71: 3368 (1993) ; Cromwell, G.L, et al., “P- A Key Essential Nutrient, Yet a Possible Mayor Pollutant- Its Central Role In Animal Nutrition”, Biotechnology in the Feed Industr y ”, Proceedings Alltech 7th Annual Symposium”, pág. 133 (1991) ) . Sin embargo, los gastos del suministro limitado de fitasa comercial disponible y la inestabilidad de la actividad de la enzima ante el calor de peletización de pienso imposibilita su uso práctico en la industria animal (Jongbloed, A.W. et al., “Effect of Pelleting Mixed Feeds on Phytase Activity and Apparent Absorbability of Phosphorous and Calcium in Pigs”, Animal Feed Science and Technology, 28: 233-242 (1990) ) . Además, la fitasa producida a partir de A. niger no es presuntamente la fuente más segura para la fabricación de alimentos humanos.

La levadura puede utilizarse para producir eficazmente enzimas mientras crece en medios sencillos y económicos.

Con una secuencia señal apropiada, la enzima puede secretarse a los medios para una recogida conveniente. Algunos sistemas de expresión de levadura tienen la ventaja añadida de ser bien aceptados en la industria alimentaria y son productores seguros y eficaces de productos alimentarios.

Pichia pastoris es una levadura metilotrófica capaz de metabolizar metanol como su única fuente de carbono. Este sistema es bien conocido por su capacidad de expresar niveles altos de proteínas heterólogas. Debido a que es un eucariota, Pichia tiene muchas de las ventajas de los sistemas de expresión eucariótica superiores tales como procesamiento, plegamiento y modificación postranscripcional de proteínas.

Por tanto, existe la necesidad de desarrollar un sistema eficaz y sencillo para producir económicamente fitasa para aplicación a la industria de alimentos y piensos.

Sumario de la invención La presente invención se refiere a un método de producción de fitasa en levadura que comprende proporcionar un gen appA aislado a partir de células bacterianas, codificando dicho gen appA una proteína o polipéptido con actividad fitasa, expresar dicho gen appA en una cepa de levadura y aislar la proteína o polipéptido expresado.

La presente invención se refiere también a una proteína o polipéptido obtenible mediante dicho método y que tiene actividad fitasa, con una actividad óptima en el intervalo de temperatura de 57-65ºC a un pH de 2, 5 a 3, 5 o de 5, 5. El pH óptimo a 2, 5 a 3, 5 es particularmente importante para la fitasa porque ese es el pH del estómago de los animales.

La invención proporciona adicionalmente una cepa de levadura que comprende un gen appA aislado a partir de células bacterianas, codificando dicho gen appA una proteína o polipéptido con actividad fitasa y que está ligado funcionalmente a un promotor capaz de expresar fitasa en levadura, en la que dicha proteína o polipéptido tiene una termoestabilidad aumentada cuando se expresa en una célula hospedadora de levadura en comparación con la de dicha proteína o polipéptido expresado en una célula hospedadora no de levadura.

Es aún otro aspecto de la invención un vector que comprende un gen appA aislado a partir de células bacterianas, codificando dicho gen una proteína o polipéptido con actividad fitasa; un promotor ligado funcionalmente al gen appA, siendo dicho promotor capaz de iniciar la transcripción en levadura; y un origen de replicación capaz de mantener el vector en levadura, en el que dicha proteína o polipéptido tiene una termoestabilidad aumentada cuando...

1. Un método de producción de fitasa en levadura que comprende:

proporcionar un gen appA aislado a partir de células bacterianas, codificando dicho gen appA una proteína o polipéptido con actividad fitasa, expresar dicho gen appA en una cepa de levadura, y aislar la proteína o polipéptido expresado.

2. El método según la reivindicación 1, en el que la proteína o polipéptido, conducido por un péptido señal, se secreta por la célula en los medios de crecimiento o sólo se expresa intracelularmente.

3. El método según la reivindicación 2, en el que la proteína o polipéptido se secreta en los medios de crecimiento y tiene una concentración mayor de 300 unidades/ml.

4. El método según la reivindicación 1, en el que el gen appA se ayusta en fase con un elemento potenciador transcripcional.

5. El método según la reivindicación 1, en el que el gen appA es portado por un vector estable.

6. El método según la reivindicación 1, en el que el gen appA es portado por un cromosoma artificial.

7. El método según la reivindicación 1, en el que el gen appA se integra en el cromosoma de la cepa de levadura.

8. El método según la reivindicación 1, en el que la cepa de levadura se selecciona del grupo constituido por Saccharomyces, Kluyveromyces, Torulaspora y Schizosaccharomyces.

9. El método según la reivindicación 8, en el que la cepa de levadura es Saccharomyces cerevisiae.

10. El método según cualquier reivindicación precedente, en el que el gen appA se aísla a partir de Escherichia coli.

11. El método según la reivindicación 1, en el que la cepa de levadura es una cepa de levadura metilotrófica.

12. El método según la reivindicación 11, en el que la cepa de levadura metilotrófica es Pichia pastoris.

13. La proteína o polipéptido obtenible mediante un método según la reivindicación 1, que tiene actividad fitasa con una actividad óptima en un intervalo de temperatura d.

5. 65ºC y a un pH de 2, 5 a 3, 5 ó 5 a 5, 5.

14. La proteína o polipéptido según la reivindicación 13, en el que el intervalo de temperatura para actividad óptima es de 58 a 62ºC.

15. La proteína o polipéptido según la reivindicación 13 que tiene actividad fitasa, en el que la proteína retiene al menos un 40% de su actividad después de calentar la proteína durante 15 minutos a 90ºC.

16. La proteína o polipéptido de la reivindicación 15, en el que la proteína retiene entre un 40% y un 60% de su actividad después de calentar la proteína durante 15 minutos a 90ºC.

17. La proteína o polipéptido según la reivindicación 13 que tiene actividad fitasa, en el que la proteína retiene al menos un 60% de su actividad después de calentar la proteína durante 15 minutos a 60ºC.

18. Una cepa de levadura que comprende:

un gen appA aislado a partir de células bacterianas, codificando dicho gen appA una proteína o polipéptido con actividad fitasa y que está funcionalmente ligado a un promotor capaz de expresar fitasa en levadura, en la que dicha proteína o polipéptido tiene termoestabilidad aumentada cuado se expresa en una célula hospedadora de levadura en comparación con la de dicha proteína o polipéptido expresado en una célula hospedadora no de levadura.

19. La cepa de levadura según la reivindicación 18, en la que el gen appA se aísla a partir de Escherichia coli.

20. La cepa de levadura según la reivindicación 18, en la que la cepa de levadura se selecciona del grupo constituido por Saccharomyces, Kluyveromyces, Torulaspora y Schizosaccharomyces.

21. La cepa de levadura según la reivindicación 20, en la que la cepa de levadura es Saccharomyces cerevisiae.

22. La cepa de levadura según la reivindicación 19, en la que la cepa de levadura es una cepa de levadura metilotrófica.

23. La cepa de levadura según la reivindicación 22, en la que la cepa de levadura metilotrófica es Pichia pastoris.

24. Un vector que comprende

un gen appA aislado a partir de células bacterianas, codificando dicho gen appA una proteína o polipéptido con actividad fitasa;

un promotor ligado funcionalmente al gen appA, siendo capaz dicho promotor de iniciar la transcripción en levadura; y

un origen de replicación capaz de mantener el vector en levadura, en el que dicha proteína o polipéptido tiene termoestabilidad aumentada cuado se expresa en una célula hospedadora de levadura en comparación con la de dicha proteína o polipéptido expresado en una célula hospedadora no de levadura.

25. El vector según la reivindicación 24, que comprende adicionalmente: un marcador detectable.

26. El vector según la reivindicación 25, en el que el marcador detectable se selecciona del grupo constituido por URA3, LEU2, TRP1, HIS3, HIS4, ARG4 y un gen de resistencia a antibiótico.

27. El vector según la reivindicación 24, que comprende adicionalmente: un origen de replicación capaz de replicación en una célula bacteriana.

28. El vector según la reivindicación 27, en el que el origen de replicación se selecciona del grupo constituido por ColE1, Ori y oriT.

29. El vector según la reivindicación 24, en el que el gen appA se aísla a partir de Escherichia coli.

30. Un método de conversión de fitato en inositol y fósforo inorgánico, que comprende:

proporcionar un gen appA aislado a partir de células bacterianas;

expresar una proteína o polipéptido con actividad fitasa a partir de dicho gen en una célula hospedadora de levadura; y

poner en contacto la proteína o polipéptido con fitato para catalizar la conversión de fitato en inositol y fósforo inorgánico.

31. El método según la reivindicación 30, en el que el fitato está contenido en alimento o pienso.

32. El método según la reivindicación 30, en el que el gen appA se aísla a partir de Escherichia coli.