Método y complejos portadores para suministrar moléculas a células.

Un complejo portador que comprende una enzima y un péptido catiónico aromático,

donde el péptido catiónico aromático es:

(a) Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH2 (DALDA); o

(b) 2',6'-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2 (Dmt1-DALDA); o

(c) Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2 (Phe1-DALDA); o

(d) D-Arg-2',6'Dmt-Lys-Phe-NH2; o

(e) 2',6'-Dmp-D-Arg-Phe-Lys-NH2 (Dmp1-DALDA).

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E13159237.

Solicitante: CORNELL RESEARCH FOUNDATION, INC..

Inventor/es: ZHAO,KESHENG, SZETO,HAZEL, BIRK,ALEX V, ROBERTSON,HUGH D.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61K47/48 SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L;   composiciones a base de jabón C11D). › A61K 47/00 Preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos utilizados, p. ej. portadores, aditivos inertes. › estando el ingrediente no activo químicamente unido al ingrediente activo, p. ej. conjugados polímero-medicamento.
  • A61K48/00 A61K […] › Preparaciones medicinales que contienen material genético que se introduce en las células del cuerpo vivo para tratar enfermedades genéticas; Terapia génica.
  • A61K9/127 A61K […] › A61K 9/00 Preparaciones medicinales caracterizadas por un aspecto particular. › Liposomas.
  • A61P31/00 A61 […] › A61P ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS O DE PREPARACIONES MEDICINALES.Antiinfecciosos, es decir antibióticos, antisépticos, quimioterápicos.
  • A61P35/00 A61P […] › Agentes antineoplásicos.
  • A61P39/06 A61P […] › A61P 39/00 Protectores generales o productos antitóxicos. › Antirradicales libres o antioxidantes.
  • C07K5/00 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › Péptidos con hasta cuatro aminoácidos en una secuencia totalmente determinada; Sus derivados.
  • C07K5/10 C07K […] › C07K 5/00 Péptidos con hasta cuatro aminoácidos en una secuencia totalmente determinada; Sus derivados. › Tretapéptidos.
  • C07K5/107 C07K 5/00 […] › la cadena lateral del primer aminoácido contiene carbociclos, p. ej. Phe, Tyr.
  • C07K5/11 C07K 5/00 […] › la cadena lateral del primer aminoácido contiene más grupos amino que grupos carboxilo, o sus derivados, p. ej. Lys, Arg.
  • C12N15/85 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › para células animales.
  • C12N15/87 C12N 15/00 […] › Introducción de material genético extraño utilizando procedimientos no previstos en otro lugar, p. ej. cotransformación.

PDF original: ES-2520816_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Método y complejos portadores para suministrar moléculas a células Esta invención se hizo con el apoyo gubernamental del National Institute on Drug Abuse según el Nº de concesión P01-DA-08924. El gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos en esta invención.

Antecedentes de la invención Las células biológicas son generalmente altamente selectivas en cuanto a las moléculas que se les permite pasar a través de la membrana celular. Por tanto, el suministro de compuestos, tales como moléculas pequeñas y moléculas biológicas al interior de una célula está habitualmente limitado por las propiedades físicas del compuesto. Las moléculas pequeñas y moléculas biológicas pueden, por ejemplo, ser compuestos farmacéuticamente activos.

La ausencia de suministro de dichas moléculas, incluyendo macromoléculas, tales como proteínas y ácidos nucleicos, en células in vivo, ha sido un obstáculo para el uso terapéutico, profiláctico y/o diagnóstico de una gran cantidad de compuestos potencialmente eficaces. Además, muchos compuestos que parecen prometedores in vitro, se han descartado como fármacos potenciales debido a la ausencia de capacidad de suministrar el compuesto de forma eficaz dentro de una célula, in vivo.

Varios informes han abordado el problema de suministrar compuestos a células uniendo covalentemente los compuestos a "dominios de transducción de proteínas" (PTD) . Schwarze et al. (Trends Pharmacol Sci. 2000; 21:458) y la patente de Estados Unidos Nº 6.221.355 de Dowdy describen varios PTD que pueden cruzar la bicapa lipídica de las células de un modo dependiente de la concentración. Los PTD descritos incluyen PTD derivados de la proteína tat de VIH-1, de un factor de transcripción homeótico de Drosophila codificado por el gen antenna-pedia (abreviado ANTP) , y de un factor de transcripción VP22 del virus del herpes simple. El PTD de tat de VIH-1 es de once aminoácidos de longitud, El PTD de ANTP es dieciséis aminoácidos de longitud, y el PTD de VP22 es de 34 aminoácidos de longitud.

Recientes publicaciones, sin embargo, indican que estos PTD entran en las células mediante endocitosis dependiente de energía. Por lo tanto, los complejos "PTD-carga" están contenidos dentro de las vesículas endosómicas de la célula y no disponibles para, por ejemplo, el citoplasma de la célula. Por consiguiente, los complejos "PTD-carga" deben liberarse de las vesículas endosómicas para ser bioactivos (Richard et al., J Biol. Chem. 2003; 278: 585-590; Drin et al., J Biol. Chem. 2003; 278: 31192-31201) . Además, existen informes recientes de que estos PTD son tóxicos para las células.

Por tanto, existe la necesidad de péptidos que sean capaces de cruzar la membrana lipídica de las células de un modo no endocitótico e independiente de energía. Además, para evitar las respuestas inmunes, habitualmente conocidas para péptidos grandes, existe la necesidad de péptidos más pequeños, resistentes a peptidasa. Finalmente, es importante que los vehículos peptídicos sean no tóxicos para las células.

Sumario de la invención Estas necesidades se han cumplido mediante la presente invención. Específicamente, la presente invención 45 proporciona un complejo portador que comprende una enzima y un péptido catiónico aromático, donde el péptido catiónico aromático es:

(a) Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH2 (DALDA) ; o

(b) 2â?, 6â?-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2 (Dmt1-DALDA) ; o

(c) Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2 (Phe1-DALDA) ; o

(d) D-Arg-2â?, 6â?Dmt-Lys-Phe-NH2; o

(e) 2â?, 6â?-Dmp-D-Arg-Phe-Lys-NH2 (Dmp1-DALDA) .

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un 55 complejo portador de la presente invención y un vehículo o excipiente farmacéutico.

Además, la presente invención proporciona un complejo portador de la presente invención para su uso en el tratamiento del cuerpo humano o animal.

Además también, la presente invención proporciona un método para suministrar una enzima a una célula in vitro, comprendiendo el método poner en contacto la célula in vitro con un complejo portador de la presente invención.

Breve descripción de las figuras 65 Figura 1. Captación de péptido en células Caco-2. Curso de tiempo de captación de [3H] [Dmt1]DALDA (A) y [14C]Gly-Sar (B) . Las células Caco-2 se incubaron con [3H][Dmt1]DALDA (250 nM, 47 Ci/mmol) o [14C]Gly-Sar (50

ï?­M, 56, 7 mCi/mmol) durante 1 h a 37 o 4º C. Posteriormente se determinó la radiactividad en células solubilizadas. (C) Efectos de lavado con ácido sobre la acumulación de [3H][Dmt1]DALDA. Las células Caco-2 se incubaron con [3H][Dmt1]DALDA durante 1 h a 37º C. Antes de la lisis celular, las células se sometieron a lavado con ácido para retirar la radiactividad asociada a superficie celular. (D) Efecto de la concentración de [Dmt1]DALDA sobre la captación de [Dmt1]DALDA. Las células se incubaron con un intervalo de concentraciones de [Dmt1]DALDA (1 ï?­M-3 mM) durante 1 h a 37º C. Todos los datos se presentan como la media ï± E.T. de tres monocapas independientes. Donde no son evidentes barras de error, son más pequeñas que el símbolo.

Figura 2. Efecto del pH y DEPC sobre la captación de [3H][Dmt1]DAL-DA (A y C) y [14C]Gly-Sar (B y D) en células Caco-2. Las células Caco-2 se incubaron con [3H][Dmt1]DALDA (250 nM, 47 Ci/mmol) o [14C]Gly-Sar (50 ï?­M, 56, 7 mCi/mmol) durante 1 h a 37º C en diversas condiciones de pH (A y B) . Las células se preincubaron a 24º C con DEPC 0, 2 mM durante 10 min. antes de la incubación con [3H][Dmt1]DALDA (250 nM, 47 Ci/mmol) o [14C]Gly-Sar (50 ï?­M, 56, 7 mCi/mmol) a 37º C durante 1 h (C y D) . Todos los datos se presentan como la media ï±

E.T. de tres monocapas independientes.

Figura 3. (A) Captación de [3H][Dmt1]DALDA en diferentes líneas celulares. Las células se incubaron con [3H][Dmt1]DAL-DA (250 nM, 47 Ci/mmol) durante 1 h a 37º C. Antes de la lisis celular, las células se sometieron a lavado con ácido para retirar la radiactividad asociada a superficie celular. Los datos mostrados representan radiactividad resistente a ácido y se presentan como la media ï± E.T. para tres monocapas independientes. (B) Unión específica de [3H][Dmt1]DALDA a membranas celulares. Se incubaron membranas preparadas a partir de células SH-SY5Y y células Caco-2 con [3H][Dmt1]DALDA (15-960 pM) durante 1 h a 25º C. La unión no específica se evaluó por inclusión de [Dmt1]DALDA no marcado 1 ï?­M. El radioligando libre se separó del radioligando unido por filtración rápida. No se observó unión específica con células Caco-2. Para células SH-SY5Y, el valor de Kd fue 118 pM (intervalo 87-149) y el valor de Bmax fue 96 fmol/mg de proteína.

Figura 4. (A) Flujo saliente de [3H][Dmt1]DALDA (columna rellena) y [14C]Gly-Sar (columna abierta) . Las células Caco-2 se precargaron con [3H][Dmt1]DALDA (250 nM, 47 Ci/mmol) o [14C]Gly-Sar (50 ï?­M, 56, 7 mCi/mmol) durante 1 h a 37 o 4º C. Las células después se lavaron e incubaron con medio de cultivo durante 1 h a 37 o 4º C. Se determinó la radiactividad tanto en medio como en lisado celular, y los datos se presentan como el porcentaje de péptido que ha fluido al medio. (B) Efecto de DEPC sobre el flujo saliente de [3H][Dmt1]DALDA. Las células se preincubaron con DEPC 0, 2 mM durante 10 min. a 25º C antes de cargarlas con [3H][Dmt1]DALDA. (C) Efecto de verapamilo, un inhibidor de p-glucoproteína, sobre el flujo saliente (C) y captación (D) de [3H][Dmt1]DALDA.

Figura 5. Transporte de [3H][Dmt1]DALDA y [14C]Gly-Sar a través de una monocapa Caco-2. Las células Caco-2 (2 x 105) se sembraron en membrana microporosa dentro de cámaras de cultivo celular Transwell. Se determinó el transporte apical-a-basolateral de los péptidos añadiendo [3H][Dmt1]DALDA o [14C]Gly-Sar al compartimiento apical, y se retiraron alícuotas de 20 ï?­l de los compartimientos tanto apicales como basolaterales en diversos momentos después de la adición de péptido para la determinación de la radiactividad.

Figura 6. Captación celular de [Dmt1, dnsDap4]DALDA y [Dmt1, atnDap4]DALDA. Las células Caco-2 se incubaron con [Dmt1, dnsDap4]DALDA 0, 1 ï?­M durante 15 min. a 37º C. Las células después se lavaron y cubrieron con PBS. Se realizó microscopía en 10 min. a temperatura ambiente. Se realizó excitación a 340 nm y se midió la emisión a 520 nm. La fluorescencia apareció difusa en todo el citoplasma pero se excluyó completamente del núcleo. La ausencia de concentración vesicular a 37º C sugiere captación no endocitótica.

Figura 7. Confirmación espectrométrica de masas del acoplamiento de tres péptidos al enlazador cruzado SMCC. Se disolvieron SMCC (1 ï?­g) y péptido... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un complejo portador que comprende una enzima y un péptido catiónico aromático, donde el péptido catiónico aromático es: 5

(a) Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH2 (DALDA) ; o

(b) 2â?, 6â?-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2 (Dmt1-DALDA) ; o

(c) Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2 (Phe1-DALDA) ; o

(d) D-Arg-2â?, 6â?Dmt-Lys-Phe-NH2; o 10 (e) 2â?, 6â?-Dmp-D-Arg-Phe-Lys-NH2 (Dmp1-DALDA) .

2. Un complejo portador de acuerdo con la reivindicación 1, donde la enzima es ï?¡-galactosidasa.

3. Un complejo portador de acuerdo con la reivindicación 1, donde el péptido catiónico aromático es D-Arg-2â?, 6â?Dmt15 Lys-Phe-NH2.

4. Un complejo portador de acuerdo con la reivindicación 1, donde el péptido catiónico aromático o la molécula comprende un enlazador.

5. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un complejo portador definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y un vehículo o excipiente farmacéutico.

6. Un complejo portador definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso en el tratamiento del cuerpo humano o animal. 25

7. Un complejo portador para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, donde el complejo portador es para suministrar la enzima a una célula que es una célula bacteriana o una célula vegetal o una célula animal, donde la célula animal es preferiblemente una célula de mamífero, siendo preferiblemente dicha célula de mamífero una célula neuronal, una célula epitelial renal, una célula epitelial intestinal, una célula epitelial vascular, una célula epitelial de la barrera hematoencefálica, una célula de la glía o un hepatocito.

8. Un método para suministrar una enzima a una célula in vitro, comprendiendo el método poner en contacto la célula in vitro con un complejo portador definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.


 

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