MODELO ANIMAL QUIMERICO SUSCEPTIBLE A LA INFECCION POR VIRUS DE LA HEPATITIS C HUMANO.
Ratón transgénico quimérico huésped infectado con el virus de la hepatitis C humano (VHC) que comprende:
un ratón transgénico inmunodeficiente, deficiente en linfocitos T y B singénicos funcionales que tiene un genoma que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido activador del plasminógeno de tipo uroquinasa, en el que el polinucleótido está unido operativamente a un promotor de manera que el polipéptido se expresa en células hepáticas del ratón huésped, y en el que el huésped es homocigoto para el polinucleótido, y
un hígado quimérico que comprende hepatocitos humanos aislados de tejido hepático humano injertado en un hígado de ratón huésped,
en el que el hospedador infectado se caracteriza por la producción de al menos aproximadamente 103 partículas virales/ml de suero,
en el que los hepatocitos humanos constituyen al menos aproximadamente el 20% de hepatocitos en el hígado quimérico y
son funcionales durante al menos aproximadamente 15 semanas y
en el que la infección con VHC se mantiene durante al menos 5 semanas
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/CA01/00350.
Solicitante: KNETEMAN, NORMAN M.
TYRRELL, LORNE D.
MERCER, DAVID F.
Nacionalidad solicitante: Canadá.
Dirección: 492 RONNING STREET,EDMONTON, ALBERTA T6R 1B7.
Inventor/es: KNETEMAN,NORMAN M, TYRRELL,LORNE D, MERCER,DAVID F.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 2 de Junio de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- A01K67/027B
- A01K67/027M
- C07K14/765 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Seroalbúmina, p. ej. HSA.
- C12N15/63 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Introducción de material genético extraño utilizando vectores; Vectores; Utilización de huéspedes para ello; Regulación de la expresión.
- C12N15/85A3
- C12N15/85A3D
Clasificación PCT:
- A01K67/027 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A01 AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA. › A01K CRÍA DE ANIMALES; AVICULTURA; APICULTURA; PISCICULTURA; PESCA; ANIMALES PARA CRIA O REPRODUCCIÓN, NO PREVISTOS EN OTRO LUGAR; NUEVAS VARIEDADES DE ANIMALES. › A01K 67/00 Cría u obtención de animales, no prevista en otro lugar; Nuevas razas de animales. › Nuevas razas de vertebrados.
- A61K49/00 A […] › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › Preparaciones para examen in vivo.
- C12N7/00 C12N […] › Virus, p. ej. bacteriófagos; Composiciones que los contienen; Su preparación o purificación (preparaciones de uso médico que contienen virus A61K 35/76; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos virales, p. ej. vacunas virales, A61K 39/00).
- C12N9/64 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › que provienen de tejido animal, p. ej. renina.
Clasificación antigua:
- A01K67/027 A01K 67/00 […] › Nuevas razas de vertebrados.
- A61K49/00 A61K […] › Preparaciones para examen in vivo.
- C12N7/00 C12N […] › Virus, p. ej. bacteriófagos; Composiciones que los contienen; Su preparación o purificación (preparaciones de uso médico que contienen virus A61K 35/76; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos virales, p. ej. vacunas virales, A61K 39/00).
- C12N9/64 C12N 9/00 […] › que provienen de tejido animal, p. ej. renina.
Fragmento de la descripción:
Modelo animal quimérico susceptible a la infección por virus de la hepatitis C humano.
La presente invención está relacionada, en general, con el campo de las enfermedades infecciosas, particularmente con modelos de patógenos virales.
La enfermedad hepática humana producida por el virus de la hepatitis C (VHC) se ha presentado a lo largo de la última década como uno de los retos más difíciles con los que se enfrenta la comunidad médica mundial. El esclarecimiento de la secuencia viral en 1989 (Choo, et al. Science 244, 359-361 (1989)) inició la era del estudio coordinado del VHC; actualmente se estima que están infectadas hasta 175.000.000 personas (Sarbah et al. Cell 62, 447-456 (1990)). VHC es el tipo más común de hepatitis viral crónica con una prevalencia estimada del 1-2% en países desarrollados. La hepatitis crónica por el VHC deriva en cirrosis hepática en, por lo menos, un 25% de los pacientes afectados y, tras el desarrollo de la cirrosis, se estima que cada año el 1-4% de los pacientes desarrollan carcinoma hepatocelular. En Norteamérica el VHC es actualmente la indicación más común para trasplante hepático.
Actualmente, la terapia antiviral con una combinación de interferón y ribavirina es eficaz en pacientes seleccionados, pero muchos fallan en la respuesta o tienen baja tolerancia a la terapia, subrayando la necesidad de una mejora. Las tasas de respuesta prolongadas para la monoterapia con interferón oscilan entre un 20-25%, mientras que la terapia de combinación con interferón y ribavirina ha mostrado tasas de respuesta prolongada de hasta el 40%. A pesar de que están en desarrollo nuevos fármacos antivirales que se dirigen a distintas partes del genoma viral, el progreso se ha visto entorpecido severamente por la falta de un modelo animal sólido y eficaz en cuanto al coste de VHC. Los únicos hospedadores naturales del VHC son los seres humanos y los chimpancés, sin que ninguno de los dos sea válido para ensayos antivirales a gran escala.
La falta de un modelo animal pequeño reproducible para la infección por VHC ha limitado mucho la investigación de distintos factores inmunes que contribuyen a la enfermedad, así como de candidatos de vacuna para la inmunoterapia de la infección crónica por VHC. En el caso de la infección por VHC, varios informes han demostrado la presencia de un cambio de Th1 a Th2 y de células T CD4+ y CD8+ con especificidad de antígeno de VHC en estudios in vitro realizados en células T aisladas a partir de los individuos infectados con VHC. Por otra parte, se ha visto que en pacientes infectados por VHC no virémico se estimula una fuerte respuesta Th1 contra múltiples antígenos de VHC incluso muchos años después de las infecciones, lo cual sugiere que el control de la replicación de VHC puede depender de la activación eficaz de Th1 (Cramp et al. Gut 44:424-429 (1999)). La resolución de estas preguntas para proporcionar un mejor entendimiento de la respuesta inmune a VHC, y por lo tanto una nueva percepción en relación con el desarrollo de vacunas y terapias eficaces, no se puede conseguir fácilmente sin un modelo animal adecuado.
Durante los últimos años, se han hecho avances significativos en el desarrollo de modelos animales para el virus de la hepatitis B. No obstante, a pesar de su similitud en la fonética del nombre, el virus de la hepatitis B (VHB) humano y el virus de la hepatitis C (VHC) humano son virus completamente distintos, y por eso las investigaciones relacionadas con la infección por VHB no pueden extrapolarse fácilmente a la infección por VHC. Ambos virus se denominan virus de la "hepatitis" principalmente porque VHB y VHC infectan y se replican en el hígado. Aparte de esto, VHB y VHC no se parecen más que VIH y VEB, que afectan, cada uno, al sistema inmune. De hecho, VHB y VHC son tan diferentes que ni siquiera pertenecen a la misma familia filogenética. VHB pertenece a la familia de hepadnavirus con un genoma de ADN bicatenario, mientras que VHC es miembro de la familia de flavivirus, que se basa en un genoma de una sola cadena positiva de ARN.
VHB y VHC también difieren en su infectividad. VHC es menos infeccioso que una dosis equivalente de VHB, como se evidencia por las diferencias en su porcentaje de adquisición por el personal hospitalario tras las lesiones por pinchazo con agujas. Las infecciones por VHB se producen en un 2-40% de los sucesos de pinchazo con agujas contaminadas por VHB, mientras que las infecciones por VHC se producen sólo en el 3-10% de los sucesos de pinchazo con agujas contaminadas por VHC. Estas observaciones sugieren que VHC es aproximadamente de tres a cuatro veces menos infeccioso que VHB (Shapiro Surgical Clin North Amer. 75(6):1047-56 (1995)).
VHB y VHC difieren mucho en sus requisitos para la replicación así como en la carga viral durante la infección. VHB es capaz de replicarse en sistemas menos diferenciados (por ejemplo, células HepG2, Sells et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:1005 (1987)). Por el contrario, la replicación de VHC puede depender de la presencia de hepatocitos no transformados (véase, por ejemplo, Ito et al. J. Gen. Virol. 77:1043 (1995)). Los títulos virales de pacientes infectados con VHC son generalmente menores que los de pacientes infectados con VHB. Los pacientes infectados con VHB tienen niveles que varían entre 105 y 109 partículas por ml, comparado con los niveles de 102 a 107 partículas por ml de las infecciones por VHC. Estas diferencias en el título viral pueden deberse, al menos en parte, al porcentaje relativo de eliminación de partículas virales. Además, el número de copias virales por célula también es muy bajo en la infección por VHC (por ejemplo, generalmente menos de 20 copias por célula (Dhillon et al. Histopathology 26:297-309 (1995)). Esta combinación de títulos virales bajos y bajos números de copias virales por célula quiere decir que un número significativo de hepatocitos humanos debe estar infectado y produciendo virus para que pueda detectarse la infección dentro del suero.
La gama limitada de hospedadores de VHB humano y de VHC humano ha supuesto un problema en el desarrollo de modelos de infección in vitro e in vivo. Los seres humanos y los chimpancés son los únicos animales susceptibles a la infección por el VHB humano; los seres humanos, los chimpancés y tres musarañas son susceptibles a la infección por el VHC humano (Xie et al. Virology 244:513-20 (1998), que informa sobre la infección transitoria de tres musarañas con el VHC). El VHB humano infectará a células hepáticas humanas aisladas en cultivo (véase, por ejemplo, Sureau Arch. Virol. 8:3-14 (1993); Lampertico et al. Hepatology 13; 422-6 (1991)). Se ha notificado que el VHC infecta a cultivos primarios de hepatocitos humanos; sin embargo, las células no soportan la producción de viriones (Fournier et al. J Gen Virol 79(Pt 10):2367-74 (1998)). Se necesita el desarrollo de un modelo satisfactorio in vivo para proporcionar un medio clínicamente más relevante para ensayar agentes terapéuticos candidatos. La gama extremadamente estrecha de hospedadores de VHB y VHC ha dificultado mucho el desarrollo de modelos animales. Los modelos animales actuales de VHB y VHC no implican el curso normal de la infección, requieren el uso de células hepáticas humanas previamente infectadas o ambas cosas (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 5.709.843; 5.652.373; 5.804.160; 5.849.288; 5.858.328; y 5.866.757; que describen un modelo de ratón quimérico para la infección por VHB mediante el trasplante de células hepáticas humanas infectadas con VHB debajo de la cápsula renal de ratón; el documento WO 99/16307 and Galun et al. J. Infect. Dis. 172:25-30 (1995), que describe el trasplante de hepatocitos humanos infectados con VHC en hígado de ratones inmunodeficientes; Bronowicki et al. Hepatology 28:211-8 (1998), que describe la inyección intraperitoneal de células hematopoyéticas infectadas con VHC en ratones SCID; y Lerta et al. Hepatology 28(4Pt2):498A (1998), que describe ratones transgénicos para el genoma de VHC). La infección por el VHB humano se imita bastante bien por la infección de marmotas con el virus de la hepatitis de la marmota (VHM) y por la infección de patos pequineses con el virus de la hepatitis del pato (VHP). Marmotas infectadas con VHM y patos infectados con VHP se han utilizado con éxito para identificar fármacos eficaces contra la infección por el VHB humano de seres humanos. Sin embargo, no se ha identificado ningún modelo animal de infección análogo para el VHC humano.
Reivindicaciones:
1. Ratón transgénico quimérico huésped infectado con el virus de la hepatitis C humano (VHC) que comprende:
un ratón transgénico inmunodeficiente, deficiente en linfocitos T y B singénicos funcionales que tiene un genoma que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido activador del plasminógeno de tipo uroquinasa, en el que el polinucleótido está unido operativamente a un promotor de manera que el polipéptido se expresa en células hepáticas del ratón huésped, y en el que el huésped es homocigoto para el polinucleótido, y
un hígado quimérico que comprende hepatocitos humanos aislados de tejido hepático humano injertado en un hígado de ratón huésped,
en el que el hospedador infectado se caracteriza por la producción de al menos aproximadamente 103 partículas virales/ml de suero,
en el que los hepatocitos humanos constituyen al menos aproximadamente el 20% de hepatocitos en el hígado quimérico y
son funcionales durante al menos aproximadamente 15 semanas y
en el que la infección con VHC se mantiene durante al menos 5 semanas.
2. El ratón quimérico huésped de la reivindicación 1, en el que el huésped infectado mantiene una infección por VHC detectable de manera constante durante un periodo de al menos 15 semanas.
3. El ratón quimérico huésped de la reivindicación 1, en el que el promotor es un promotor de albúmina de ratón.
4. El ratón quimérico huésped de la reivindicación 1, en el que la inmunodeficiencia es resultado de un defecto genético en la reorganización del gen receptor de célula T e inmunoglobulina.
5. El ratón quimérico huésped de la reivindicación 1, en el que la inmunodeficiencia del huésped está producida por una mutación scid.
6. Procedimiento de producción de un ratón transgénico quimérico huésped infectado con el virus de la hepatitis C humano (VHC), comprendiendo el procedimiento:
la implantación de hepatocitos humanos aislados de tejido hepático humano en un ratón transgénico inmunodeficiente huésped deficiente en linfocitos T y B singénicos funcionales y que tiene un genoma que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido activador de plasminógeno de tipo uroquinasa, en el que el polinucleótido está unido operativamente a un promotor, de manera que el polipéptido se expresa en células hepáticas de ratón huésped y en el que el huésped es homocigoto para el polinucleótido; de manera que los hepatocitos humanos se injertan en el hígado huésped para producir un hígado quimérico humano-ratón, y
la inoculación de VHC humano al huésped;
en el que se produce un ratón transgénico quimérico huésped que comprende un hígado quimérico humano-ratón y que tiene una infección por VHC humano y en el que el huésped infectado se caracteriza por la producción de al menos aproximadamente 103 partículas virales/ml de suero
en el que los hepatocitos humanos constituyen al menos el 20% de los hepatocitos en el hígado quimérico y son funcionales durante al menos 15 semanas, y;
en el que la infección con VHC se mantiene durante al menos 5 semanas.
7. Procedimiento de cultivo del virus de la hepatitis C humana (VHC), comprendiendo el procedimiento:
la administración de VHC humano al ratón transgénico quimérico huésped de la reivindicación 1; y
el aislamiento del VHC humano del huésped infectado después de la replicación del VHC humano en el huésped.
8. Procedimiento para cribar agentes candidatos con respecto a la actividad frente a un patógeno hepatotrofo, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
la administración de un agente candidato al ratón transgénico quimérico huésped de la reivindicación 1, y
el análisis del efecto del agente candidato tras la infección con VHC;
en el que una disminución en la carga infecciosa del VHC humano en relación con un ratón transgénico quimérico huésped no tratado o en relación con una carga infecciosa en el ratón transgénico quimérico huésped antes de la administración del agente candidato es indicativa de actividad anti-VHC del agente.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el agente candidato se administra antes de la infección con VHC humano.
10. El procedimiento de la reivindicación 9, que comprende la reconstitución del sistema inmune del ratón transgénico quimérico huésped, en el que el agente candidato es un candidato a vacuna para inmunoterapia activa.
11. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el agente inmunoterapéutico es un anticuerpo anti-VHC o un fragmento del mismo de unión a VHC.
12. El procedimiento de la reivindicación 8, que comprende la reconstitución del sistema inmune del ratón transgénico quimérico huésped en el que el agente candidato es un candidato a vacuna para la vacunación terapéutica.
13. El procedimiento de la reivindicación 8, que comprende la reconstitución del sistema inmune del ratón transgénico quimérico huésped en el que el agente candidato es un agente inmunoterapéutico.
14. Procedimiento para cribar agentes candidatos con respecto a la actividad en alcanzar una disminución de los lípidos en la sangre, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
la administración de un agente candidato al ratón transgénico quimérico huésped de la reivindicación 1, y
el análisis del efecto del agente candidato en la lipoproteína sérica apoB100;
en el que la detección de un nivel de apoB100 después de la administración del agente candidato que está disminuido en relación con el nivel de apoB100 antes de la administración del agente candidato indica que el agente candidato tiene actividad en disminuir los lípidos de la sangre.
15. Procedimiento para evaluar la toxicidad en el hígado de un agente, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
la administración de un agente candidato a un ratón transgénico quimérico huésped inmunodeficiente de acuerdo con la reivindicación 1
el análisis del efecto del agente candidato en la función hepática o en la histología hepática
en el que una disminución en la función del hígado o una alteración adversa en la histopatología del hígado en el huésped tratado en relación a un ratón quimérico huésped no tratado o en relación con la función o histología hepática antes de la administración del agente candidato indica que el agente es tóxico para las células hepáticas.
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