ANTICUERPOS DIRIGIDOS CONTRA LA ANGIOPOYETINA-2 Y USOS DE LOS MISMOS.

Anticuerpos dirigidos contra la angiopoyetina-2 y usos de los mismos CAMPO La invención se refiere a anticuerpos monoclonales contra la angiopoyetina-2 (Ang-2) y a usos de este tipo de anticuerpos. Más específicamente, la invención se refiere a anticuerpos monoclonales totalmente humanos dirigidos contra Ang-2 y a usos de estos anticuerpos. Aspectos de la invención se refieren también a hibridomas o a otras líneas celulares que expresan este tipo de anticuerpos. Los anticuerpos descritos son útiles como agentes de diagnóstico y para el tratamiento de enfermedades asociadas con la actividad y/o supraproducción de Ang-2. ANTECEDENTES La angiogénesis es el proceso de formar nuevos capilares a partir de vasos sanguíneos pre-existentes, y es un componente esencial de la embriogénesis, el desarrollo normal fisiológico, la reparación y expansión de tumores. A pesar de que una diversidad de factores pueden modular respuestas de células endoteliales (CE) in vitro y el crecimiento de vasos sanguíneos in vivo, se piensa que únicamente miembros de la familia del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF siglas en inglés) y las angiopoyetinas actúan casi exclusivamente sobre BCs vasculares. Yancopoulos et al., Nature 407:242-48 (2000). Las angiopoyetinas fueron descubiertas como ligandos para los Ties, una familia de tirosina quinasas que es expresada selectivamente dentro del endotelio vascular. Yancopoulos et al., Nature 407:242-48 (2000). Existen ahora cuatro miembros definitivos de la familia de las angiopoyetinas. Angiopoyetina-3 y -4 (Ang-3 y Ang-4) pueden representar homólogos ampliamente divergentes del mismo locus del gen en ratones y el hombre. Kim et al., FEBS Let; 443:353-56 (1999); Kim et al., J. Biol. Chem 274:26523-28 (1999). Ang-1 y Ang-2 fueron originalmente identificados en experimentos de cultivo tisular como agonistas y antagonistas, respectivamente. Davis et al., Cell 87:1161-69 (1996); Maisonpierre et al., Science 277: 55-60 (1997). Todas las angiopoyetinas conocidas se unen principalmente a Tie2, y tanto Ang-1 como -2 se unen a Tie2 con una afinidad de 3 nM (Kd), Maisonpierre et al., Science 277: 55-60 (1997). Ang-1 demostró soportar la supervivencia de CE y fomentar la integridad del endotelio, Davis et al., Cell 87: 1161-69 (1996); Kwak et al., FEBS Lett 448: 249-53 (1999); Suri et al., Science 282: 468-71 (1998); Thurston et al., Science 286: 2511-14 (1999); Thurston et al., Nat. Med. 6: 460-63 (2000), mientras que Ang- 2 tenía el efecto opuesto y fomentaba la desestabilización y regresión de los vasos sanguíneos en ausencia de los factores de supervivencia VEGF o del factor de crecimiento de fibroblastos básico. Maisonpierre et al., Science 277: 55-60 (1997). Sin embargo, muchos estudios de la función de Ang-2 han sugerido una situación más compleja. Ang- 2 podría ser un regulador complejo de la remodelación vascular que juega un papel tanto en el brote de los vasos como en la regresión de los vasos. Análisis de expresión que sustentan dichos papeles para Ang-2 revelan que Ang- 2 es rápidamente inducida, junto con VEGF, en estipulaciones adultas de brotes angiogénicos, mientras que Ang-2 es inducida en ausencia de VEGF en estipulaciones de regresión vascular. Holash et al., Science 284: 1994-98 (1999); Holash et al., Oncogene 18: 5356-62 (1999). Consistente con un papel dependiente del contexto, Ang-2 se une al mismo receptor específico endotelial Tie-2, que es activado por Ang-1, pero que tiene efectos dependientes del contexto sobre su activación. Maisonpierre et al., Science 277: 55-60 (1997). Ensayos de la angiogénesis de la córnea han demostrado que tanto Ang-1 como Ang-2 tenían efectos similares, actuando sinérgicamente con VGEF para fomentar el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos. Asahara et al., Circ. Res. 83: 233-40 (1998). La posibilidad de que existiera una respuesta endotelial dependiente de la dosis fue planteada por la observación de que in vitro a elevada concentración, Ang-2 puede también ser pro-angiogénica. Kim et al., Oncogene 19: 4549-52 (2000). A una elevada concentración, Ang-2 actúa como un factor de la supervivencia de la apoptosis para células endoteliales durante la apoptosis por privación de suero a través de la activación de Tie2 a través de la vía de la quinasa PI-3 y Akt. Kim et al., Oncogene 19: 4549-52 (2000). Otros experimentos in vitro sugirieron que durante exposición continua, los efectos de Ang-2 pueden cambiar progresivamente desde los de un antagonista a un agonista de Tie2, y en instantes posteriores, pueden contribuir directamente a la formación del tubo vascular y a una estabilización neovascular. Teichert-Kuliszewska et al., Cardiovasc. Res. 49: 659-70 (2001). Además, si las CEs se cultivaban en gel de fibrina, también se observó una activación de Tie2 con Ang-2, sugiriendo quizás que la acción de Ang-2 podría depender del estado de diferenciación de CE. Teichert-Kuliszewska et al., Cardiovasc. Res. 49: 659-70 (2001). En CE microvasculares cultivadas en un gel de colágeno tridimensional, Ang-2 puede también inducir la activación de Tie2 y fomentar la formación de estructuras similares a capilares. Mochizuki et al., J. Cell. Sci. 115: 175-83 (2002). El uso de un co-cultivo esferoidal en 3-D como un modelo in vitro de la maduración de los vasos demostró que el contacto directo entre CEs y células mesenquimales abroga la capacidad de respuesta a VEGF, mientras que la presencia de VEGF y Ang-2 inducía el brote. Korff et al., Faseb J. 15: 447-57 (2001). Etoh et al. demostraron que las CEs que expresan constitutivamente Tie2, la expresión de MMP-1, -9 y u-PA fueron fuertemente suprarreguladas por parte de Ang-2 en presencia de VEGF. Etoh et al., Cancer Res. 61: 2145-53 (2001). Con un modelo de membrana pupilar in vivo, Lobov et al., 2   demostraron que Ang-2, en presencia de VEGF endógeno, fomenta un aumento rápido en el diámetro capilar, remodelando la lámina basal, la proliferación y migración de células endoteliales y estimula el brote de nuevos vasos sanguíneos. Lobov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 11205-10 (2002). En contraposición, Ang-2 fomenta la muerte de células endoteliales y la regresión de los vasos sin VEGF endógeno. Lobov et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99: 11205-10 (2002). De manera similar, con un modelo de tumores in vivo Vajkoczy et al. demostraron que agregados multicelulares inician el crecimiento vascular mediante el brote angiogénico a través de la expresión simultánea de VEGFR-2 y Ang-2 por parte del hospedante y del endotelio del tumor. Vajkoczy et al., J. Clin. Invest. 109: 777-85 (2002). Este modelo ilustraba que la microvasculatura establecida de tumores en desarrollo se caracteriza por una remodelación continua, mediada supuestamente por la expresión de VEGF y Ang-2. Vajkoczy et al., J. Clin. Invest. 109: 777-85 (2002). Estudios en ratones inactivados de Tie-2 y angiopoyetina-1 muestran fenotipos similares, y sugieren que la fosforilación de Tie-2 estimulada por angiopoyetina-1 media en la remodelación y estabilización de vasos en desarrollo, fomentando la maduración de vasos sanguíneos durante la angiogénesis y el mantenimiento de la adhesión de células sustentada por células endoteliales (Dumont et al., Genes & Development, 8: 1897-1909 (1994), Sato, Nature, 376:70-74 (1995); (Thurston, G. et al., 2000 Nature Medicine: 6, 460-63)). Se piensa que el papel de angiopoyetina-1 se conserva en el adulto, en donde se expresa ampliamente y de forma constitutiva (Hanahan, Science, 277: 48-50 (1997); Zagzag, et al., Exp Neurology, 159:391-400 (1999)). En contraposición, la expresión de angiopoyetina-2 está principalmente limitada a sitios de remodelación vascular en donde se piensa que bloquea la estabilización constitutiva o la función de maduración de angiopoyetina-1, permitiendo que se inviertan los vasos y que permanezcan en un estado plástico que pueda tener una mayor respuesta a señales de brote (Hanahan, 1997; Holash et al., Oncogene 18: 5356-62 (1999); Maisonpierre, 1997). Estudios de la expresión de la angiopoyetina-2 en angiogénesis patológica han encontrado que muchos tipos de tumores muestran una expresión vascular de angiopoyetina-2 (Maisonpierre et al., Science 277: 55-60 (1997)). Estudios funcionales sugieren que la angiopoyetina-2 está implicada en la angiogénesis de tumores y asocian la sobreexpresión de angiopoyetina-2 con un crecimiento incrementado del tumor en un modelo de xenoinjerto en ratones (Ahmad, et al., Cancer Res., 61: 1255-1259 (2001)). Otros estudios han asociado la sobreexpresión de angiopoyetina-2 con una hipervascularidad del tumor (Etoh et al., Cancer Res. 61: 2145-53 (2001); Tanaka et al., Cancer Res. 62 : 7124-29 (2002)). En los últimos años, angiopoyetina-1, angiopoyetina-2 y/o Tie-2 han sido propuestos como posibles dianas terapéuticas anti-cancerígenas. Por ejemplo, los... [Seguir leyendo]

1.- Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una cadena ligera variable que tiene una secuencia definida por SEQ ID NO: 81 y una cadena pesada variable que tiene una secuencia definida por SEQ ID NO: 79. 2.- El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo depositado como el Número de Acceso a ATCC PTA-7260 (mAb 3.19.3). 3.- Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que compite por la unión a Ang-2 con el anticuerpo depositado como el Número de Acceso a ATCC PTA-7260 (mAb 3.19.3) que une Ang-1 y Ang-2 con una Kd de menos de 100 picomolar, medida por resonancia de plasmón de superficie de alta resolución. 4.- Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno que se une al mismo epítopo sobre Ang-2 que el anticuerpo depositado como el Número de Acceso a ATCC PTA-7260 (mAb 3.19.3). 5.- Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno que se une a angiopoyetina-2 (Ang-2), en donde dicho anticuerpo comprende: a. tres CDRs de cadena pesada del anticuerpo depositado como el Número de Acceso a ATCC PTA- 7260 (mAb 3.19.3), teniendo las tres CDRs de cadena pesada las secuencias: (i) GFTFTNYGMH, (ii) VISHDGNNKYYVDSVKG, y (iii) EGIDFWSGLNWFDP; y b. tres CDRs de cadena ligera del anticuerpo depositado como el Número de Acceso a ATCC PTA- 7260 (mAb 3.19.3), teniendo las tres CDRs de cadena pesada las secuencias: (iv) RASQSITGSYLA, (v) GASSWAT, y (vi) QQYSSSPIT. 6.- Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno que se une al mismo epítopo sobre Ang-2 que el anticuerpo depositado como el Número de Acceso a ATCC PTA-7260 (mAb 3.19.3), comprendiendo el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que tiene secuencias de CDR: (i) GFTFTNYGMH, (ii) VISHDGNNKYYVDSVKG, y (iii) EGIDFWSGLNWFDP, y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que tiene secuencias de CDR (iv) RASQSITGSYLA, (v) GASSWAT, y (vi) QQYSSSPIT. 7.- Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que es un anticuerpo monoclonal. 8.- Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 ó 6, que es un anticuerpo policlonal. 9.- Uso de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o un fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor maligno. 10.- El uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde dicho tumor maligno se selecciona del grupo que consiste en: melanoma, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, glioma, carcinoma hepatocelular (del hígado), tumor de tiroides, cáncer gástrico (del estómago), cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de ovarios, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, glioblastoma, cáncer endometrial, cáncer de riñón, cáncer de colon, cáncer pancreático y carcinoma epidermoide. 316   11.- El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o un fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para uso en el tratamiento de un tumor maligno. 12.- El anticuerpo o fargmento de unión a antígeno de la reivindicación 11, en donde dicho tumor maligno se selecciona del grupo que consiste en: melanoma, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, glioma, carcinoma hepatocelular (del hígado), tumor de tiroides, cáncer gástrico (del estómago), cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de ovarios, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, glioblastoma, cáncer endometrial, cáncer de riñón, cáncer de colon, cáncer pancreático y carcinoma epidermoide. 317   318   319     321   322   323   324     326   327   328   329