Un método para evaluar la citotoxicidad celular que depende de anticuerpos (ADCC),

que comprende: (a) monitorear la impedancia entre electrodos sobre un sustrato no conductor que soporta el crecimiento de células objetivo en un medio de ensayo, en donde las células objetivo están en una monocapa sobre el sustrato; y (b) la adición al medio de ensayo de células efectoras y un anticuerpo que se enlaza a las células objetivo; en donde una disminución en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo es indicativa de que se ha efectuado la función de ADCC en el medio de ensayo, y en donde un incremento o ningún cambio en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo es indicativa de que no se ha efectuado la función de ADCC en el medio de ensayo, en donde opcionalmente el anticuerpo se deriva de un paciente con un trastorno autoinmune

CAMPO TÉCNICO

La presente solicitud se relaciona con métodos para analizar la citotoxicidad celular que depende de anticuerpos (ADCC por sus siglas en inglés) y, en algunas modalidades, se relaciona con métodos que permiten que se pueda analizar en tiempo real la ADCC sin necesidad de células marcadas. ANTECEDENTES DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

La ADCC es un componente de la respuesta inmunológica en la cual los anticuerpos IgG se enlazan con antígenos sobre la superficie de células objetivo, patógenas o tumorogénicas, que las identifica por destrucción por medio de células efectoras NK. Las células efectoras que portan al receptor Fc gamma (FcγR) reconocen y enlazan la región Fc de los anticuerpos enlazados a la célula objetivo. Los anticuerpos confieren así especificidad a la célula asesina objetivo, que es mediada por células efectoras formando un puente entre los dos tipos de células y posteriormente liberando gránulos líticos.

Algunos anticuerpos terapéuticos logran su actividad biológica promoviendo ADCC. Por ejemplo, Herceptin®, un anticuerpo humanizado utilizado para tratamiento de cáncer de seno, promueve ADCC por enlazamiento del antígeno HER-2 sobre la superficie de células cancerosas. Igualmente, Rituxan®, un anticuerpo quimérico utilizado para tratamiento de linfoma no Hodgkin, promueve ADCC por enlazamiento de antígenos CD20 sobre la superficie de las células de linfoma.

Las tecnologías para determinar si un anticuerpo induce ADCC típicamente implican etiquetar células objetivo con un material radioactivo, tal como Cr51 como se describe por ejemplo en US-A-5840313 o EP-A-1176195, o un colorante fluorescente, tal como Calceína AM. Se incuban las células etiquetadas con el anticuerpo y células efectoras tales como células NK o las PBMC, y se detecta la muerte de células objetivo por medio de ADCC por la liberación de radioactividad o fluorescencia. El etiquetado de células objetivo en tales ensayos requiere de la separación de células adherentes para etiquetado. Después del etiquetado, se lleva a cabo el análisis con las células objetivo en suspensión, que no es un estado normal para células adherentes. Además, el grado de muerte celular mediada por ADCC generalmente se determina en un solo momento varias horas después de la mezcla de las células objetivo con células efectoras y el anticuerpo. Se ha desarrollado un ensayo libre de etiquetas, en el cual se determina la muerte celular midiendo la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) a partir del citoplasma de células lisadas en el sobrenadante libre de células. Sin embargo, el método de la LDH no es un ensayo en tiempo real, y no distingue entre muerte de células objetivo y muerte de células efectoras ya que ambos tipos de células liberarán LDH en la lisis.

En vista del número de productos de anticuerpos terapéuticos que se encuentran hoy en día en el mercado o en desarrollo, existe la necesidad de ensayos in vitro que permitan determinar la actividad de ADCC de anticuerpos. En particular, existe la necesidad de un ensayo de ADCC de alto rendimiento libre de etiquetas que permita monitorear ADCC en tiempo real y que no requiera la separación de células adherentes. RESUMEN

La presente solicitud proporciona métodos para analizar ADCC in vitro. Los métodos son libres de etiquetas o requieren de niveles reducidos de etiquetas, y por lo tanto son más fáciles y seguros de llevar a cabo que los ensayos que requieren células etiquetadas. Los métodos se realizan sobre células adherentes, en vez de sobre células en suspensión. Además, se pueden llevar a cabo los métodos en tiempo real, permitiendo seguir la cinética de las reacciones de ADCC de tal manera que se puedan comparar las cinéticas de ADCC de diferentes anticuerpos. Los métodos suministrados aquí son más sensibles también que los ensayos estándar de ADCC, permitiendo detectar diferencias menores en la cinética de ADCC de diferentes anticuerpos. Además, en algunas modalidades la simplicidad de los métodos suministrados aquí significa que son más rápidos que los análisis estándar de ADCC, y también tienen el potencial para ser optimizados por selección de alto rendimiento de la actividad de ADCC.

Los métodos suministrados aquí comprenden (a) el monitoreo de la impedancia entre electrodos sobre un sustrato no conductor que soporta el crecimiento de células objetivo en un medio de ensayo; y (b) la adición al medio de ensayo de células efectoras y un anticuerpo que se enlaza a las células objetivo. Una disminución en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo es indicativa de ADCC que ha sido efectuada en el medio de ensayo. Un incremento o ningún cambio en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo pueden ser indicativos de que no ha sido efectuada la función de ADCC en el medio de ensayo.

En un aspecto, la presente solicitud presenta un método para analizar la citotoxicidad celular

que depende de anticuerpos (ADCC), que comprende: (a) monitorear la impedancia entre electrodos sobre un sustrato no conductor que soporta el crecimiento de células objetivo en un medio de ensayo en donde las células objetivo están en una monocapa sobre el sustrato; y (b) la adición al medio de ensayo de células efectoras y un anticuerpo que se enlaza a las células objetivo; en donde una disminución en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo es indicativa de que se ha efectuado la función de ADCC en el medio de ensayo, y en donde un incremento o ningún cambio en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo es indicativa de que no se ha efectuado la función de ADCC en el medio de ensayo. El método puede incluir la medición de la impedancia a intervalos regulares. El método puede incluir derivar un Índice de Células (CI) a partir de cada medición de impedancia y determinar si se presenta un cambio en el Índice de Células, en donde el Índice de Células se deriva a partir de cada medición de impedancia utilizando la fórmula

**(Ver fórmula)**

en donde Rb(f) y Rcélula(f) son las resistencias de electrodo que dependen de la frecuencia sin células o con células presentes, respectivamente, y N es el número de los puntos de frecuencia en los cuales se mide la impedancia. El método se puede realizar utilizando el sistema RT-CES®. Las mediciones de impedancia se pueden tomar cada 15 minutos.

El método puede sembrar además en placa las células objetivo. Las células objetivo pueden ser sembradas en placa 18 a 24 horas antes de la adición del anticuerpo y las células efectoras. Las células objetivo pueden ser sembradas en placa con una densidad entre 2 K y 100 K por pozo (por ejemplo, entre 15K y 25K por pozo, o aproximadamente 20 K por pozo). La proporción de células efectoras con relación a las células objetivo (E:T) puede ser de 25:1. La proporción E:T puede ser mayor a 10:1, mayor a 50:1, o mayor a 100:1.

Se puede añadir el anticuerpo en una concentración entre 1 y 100 µg/ml, entre 1 y 50 µg/ml,

o entre 2 y 8 µg/ml. Puede incluir la adición al medio de ensayo dos o más anticuerpos que se enlazan a las células objetivo, tres o más anticuerpos que se enlazan a las células objetivo, o cuatro o más anticuerpos que se enlazan a las células objetivo. El anticuerpo puede provenir de un paciente con un trastorno autoinmune.

3 Las células objetivo pueden expresar antígenos apicales. El método puede incluir una etapa preliminar de selección de las células objetivo para expresión del antígeno apical. Las células objetivo pueden ser células cancerosas o células infectadas con virus. Las células cancerosas pueden ser de una línea celular. Las células cancerosas pueden ser células SKBR3 o células MG63. Las células efectoras pueden incluir células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células asesinas naturales (NK), monocitos, células T citotóxicas o neutrófilos. 30. La etapa (b) del método puede incluir la adición a las células objetivo de sangre entera que ha sido parcialmente enriquecida por las células efectoras. La etapa (b) del método puede incluir la adición de sangre entera a las células efectoras, en donde la sangre entera incluye las células efectoras. En otro aspecto, la presente solicitud presenta un método de selección de un anticuerpo candidato...

1. Un método para evaluar la citotoxicidad celular que depende de anticuerpos (ADCC), que comprende:

(a) monitorear la impedancia entre electrodos sobre un sustrato no conductor que soporta el crecimiento de células objetivo en un medio de ensayo, en donde las células objetivo están en una monocapa sobre el sustrato; y

(b) la adición al medio de ensayo de células efectoras y un anticuerpo que se enlaza a las

células objetivo; en donde una disminución en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo es indicativa de que se ha efectuado la función de ADCC en el medio de ensayo, y en donde un incremento o ningún cambio en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo es indicativa de que no se ha efectuado la función de ADCC en el medio de ensayo, en donde opcionalmente el anticuerpo se deriva de un paciente con un trastorno autoinmune.

2. El método de acuerdo a la reivindicación 1, que comprende la medición de la impedancia a intervalos regulares.

3. El método de acuerdo a la reivindicación 2, que comprende la derivación de un Índice de Células (CI) a partir de cada medición de impedancia y determinar si se presenta un cambio en el Índice de Células, en donde el Índice de Células se deriva de cada medición de impedancia utilizando la fórmula

en donde Rb(f) y Rcélula(f) son las resistencia del electrodo que dependen de la frecuencia sin células o con células presentes, respectivamente, y N es el número de los puntos de frecuencia en los cuales se mide la impedancia.

4. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde las mediciones de impedancia se toman cada 15 minutos.

5. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el método comprende además la siembra en placa de las células objetivo, y en donde opcionalmente las células objetivo se siembran en placa 18 a 24 horas antes de la adición del anticuerpo y de las células efectoras.

6. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde las células objetivo se siembran en placa con una densidad entre 2 K y 100 K por pozo, o en donde las células objetivo se siembran en placa con una densidad de aproximadamente 20 K por pozo.

7. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la proporción de células efectoras con respecto a células objetivo (E:T) es de 25:1, o en donde la E:T es mayor a 10:1, o en donde la E:T es mayor a 50:1, o en donde la E:T es mayor a 100:1.

8. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde se añade el anticuerpo en una concentración entre 1 y 100 µg/ml, entre 1 y50 µg/ml, o entre 2 y8 µg/ml.

9. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende la adición al medio de ensayo de dos o más anticuerpos que se enlazan a las células objetivo, o la adición al medio de ensayo de 3 o más anticuerpos que se enlazan a las células objetivo, o la adición al medio de ensayo de 4 o más anticuerpos que se enlazan a las células objetivo.

10. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde las células objetivo expresan antígenos apicales, que comprende opcionalmente una etapa preliminar de selección de células objetivo para la expresión del antígeno apical.

11. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde las células objetivo son células cancerosa o célula infectadas por virus, en donde opcionalmente las células cancerosas son de una línea de células, opcionalmente las células cancerosas son células SKBR3 o células MG63.

12. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde las células efectoras incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células asesinas naturales (NK), monocitos, células citotóxicas T o neutrófilos.

13. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la etapa (b) comprende la adición a las células objetivo de sangre entera que ha sido parcialmente enriquecida por las células efectoras, o comprende la adición de sangre entera a las células efectoras, y en donde la sangre entera incluye las células efectoras.

14. Un método para seleccionar un anticuerpo candidato por la habilidad para inducir ADCC contra células objetivo, que comprende:

(a) monitorear la impedancia entre electrodos sobre un sustrato no conductor que soporta el crecimiento de células objetivo en un medio de ensayo; y

(b) la adición de células efectoras y el anticuerpo candidato que enlaza a las células

**(Ver fórmula)**

objetivo al medio de ensayo; en donde una disminución en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo es indicativa de la habilidad del anticuerpo candidato para efectuar la función de ADCC contra las células objetivo, y en donde un incremento o ningún cambio en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo es indicativa de la inhabilidad del anticuerpo candidato para efectuar la función de ADCC contra las células objetivo.

15. Un método para identificar un paciente que tiene una enfermedad asociada con células objetivo que es adecuado para tratamiento con un anticuerpo candidato que es capaz de modular ADCC, en donde las células objetivo son 1) células sanas asociadas con una enfermedad autoinmune, 2) células infectadas con virus o 3) células cancerosas, comprendiendo el método:

(a) el monitoreo de la impedancia entre los electrodos sobre un sustrato no conductor que soporta el crecimiento de células objetivo asociadas con la enfermedad;

(b) la adición de PBMC aisladas del paciente y el anticuerpo candidato a las células objetivo; y

(c) la determinación de si un cambio en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato se presenta después de la adición de las PBMC y el anticuerpo, en donde una disminución en impedancia entre los electrodos es indicativa de lo adecuado del paciente para el tratamiento con el anticuerpo, y en donde un incremento o ningún cambio en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las PBMC y el

anticuerpo es indicativo de lo inadecuado del paciente para el tratamiento con el anticuerpo.

16. Un método de selección de un compuesto candidato por la habilidad para modular ADCC, que comprende:

(a) el monitoreo de la impedancia entre los electrodos sobre un sustrato no conductor que soporta el crecimiento de células objetivo en el medio del ensayo;

(b) la adición al medio del ensayo de células efectoras y un anticuerpo, en presencia y en ausencia del compuesto candidato, en donde el anticuerpo se enlaza a las células objetivo; y

(c) la comparación de cualquier cambio en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo en presencia del compuesto candidato con cualquier cambio en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo en ausencia del compuesto candidato, en donde un cambio en la impedancia en presencia del compuesto candidato que es mayor que cualquier cambio en la impedancia en ausencia del compuesto candidato es indicativa de que el compuesto candidato tiene la capacidad para modular ADCC,

en donde opcionalmente el compuesto que va a ser seleccionado modula la ADCC relacionada con autoinmunidad.

17. Un método de acuerdo a cualquier reivindicación previa que es un ensayo de alto rendimiento, y en donde el sustrato no conductor incluye dos o más pozos de microtitulación, comprendiendo cada pozo al menos dos electrodos, y el monitoreo de la impedancia entre los electrodos en cada pozo.

18. Un ensayo de control de calidad para un anticuerpo, que comprende:

(a) monitorear la impedancia entre electrodos sobre un sustrato no conductor que soporta el crecimiento de células objetivo en un medio de ensayo; y

(b) la adición de células efectoras y el anticuerpo al medio de ensayo, en donde el

anticuerpo se enlaza con las células objetivo; en donde una disminución en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo es indicativa de que el anticuerpo es adecuado para ser liberado para uso en inducción de ADCC, y en donde un incremento o ningún cambio en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo es indicativa de que el anticuerpo no es adecuado para ser liberado para uso en inducción de ADCC.

19. Un ensayo de control de calidad para un anticuerpo, que comprende:

(a) el monitoreo de la impedancia entre electrodos sobre un sustrato no conductor que soporta el crecimiento de células objetivo en un medio de ensayo;

(b) la adición de células efectoras y el anticuerpo al medio de ensayo, en donde el anticuerpo se enlaza a las células objetivo; y

(c) la comparación de cualquier cambio en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo con cualquier cambio en la impedancia para una muestra de control después de la adición de las células efectoras y un anticuerpo de control;

en done una disminución en la impedancia después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo que es mayor que cualquier disminución en la impedancia para la muestra de control después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo de control es indicativa

de que el anticuerpo es adecuado para ser liberado para uso en la inducción de ADCC, y en

donde la carencia de una disminución en la impedancia después de la adición de las células

efectoras y el anticuerpo que es mayor que cualquier disminución en la impedancia para la

muestra de control después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo de control es

indicativa de que el anticuerpo no es adecuado para ser liberado para uso en la inducción de

ADCC,

en donde opcionalmente una disminución en la impedancia después de la adición de las

células efectoras y el anticuerpo que es al menos 25% mayor que la disminución en la

impedancia para la muestra de control después de la adición de las células efectoras y el

anticuerpo de control es indicativa de que el anticuerpo es adecuado para ser liberado para

uso en la inducción de ADCC.

20. Un método para selección de un compuesto candidato para uso como compuesto terapéutico contra una enfermedad autoinmune, que comprende:

(a) monitorear la impedancia entre electrodos sobre un sustrato no conductor que soporta el crecimiento de células objetivo en un medio de ensayo, en donde las células objetivo son células sanas;

(b) añadir al medio de ensayo células efectoras y un anticuerpo, con y sin el compuesto candidato, en donde el anticuerpo se enlaza a las células objetivo, y en donde las células efectoras son PBMC de un individuo diagnosticado con la enfermedad autoinmune; y

(c) comparar cualquier cambio en la impedancia en presencia del compuesto candidato con cualquier cambio en la impedancia en ausencia del compuesto candidato, en donde una disminución en la impedancia en ausencia del compuesto candidato que sea mayor que cualquier disminución en la impedancia en presencia del compuesto candidato es indicativa de que el compuesto candidato es adecuado como agente terapéutico contra la enfermedad autoinmune, y en donde la falta de una disminución en la impedancia en ausencia del compuesto candidato que sea superior a cualquier disminución en la impedancia en presencia del compuesto candidato es indicativa de que el compuesto candidato no es adecuado como agente terapéutico contra la enfermedad autoinmune.

21. Un método para determinar si un anticuerpo candidato es adecuado para tratar a un individuo que tiene una enfermedad autoinmune, que comprende:

(a) monitorear la impedancia entre los electrodos sobre un sustrato no conductor que soporta el crecimiento de células objetivo asociadas con la enfermedad autoinmune; y

(b) añadir el anticuerpo candidato y las PBMC aisladas del individuo a las células objetivo; y

(c) determinar si se presenta un cambio en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las PBMC y el anticuerpo candidato, en donde una disminución en impedancia entre los electrodos es indicativa de que el anticuerpo es adecuado para el tratamiento del individuo, y en donde la falta de una disminución en impedancia entre los electrodos es indicativa de que el anticuerpo no es adecuado para el tratamiento del individuo.

22. Un método para determinar una concentración óptima de un anticuerpo para inducir una respuesta de ADCC, que comprende:

(a) monitorear la impedancia entre electrodos sobre un sustrato no conductor que soporta el crecimiento de dos o más muestras de células objetivo en un medio de ensayo; y

(b) añadir células efectoras y un anticuerpo a las dos o más muestras de células objetivo, en donde el anticuerpo se enlaza a las células objetivo, y en donde se añade el anticuerpo en diferentes concentraciones a las dos o más muestras de células objetivo;

en donde una disminución en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo es indicativa de la función de ADCC que se ha efectuado en el medio de ensayo, y en donde se determina que la concentración de anticuerpo que resulta en la mayor disminución en impedancia es la concentración óptima.

23. Un método para determinar si un anticuerpo se enlaza a un antígeno apical sobre una célula objetivo, que comprende:

(a) monitorear la impedancia entre electrodos sobre un sustrato no conductor que soporta el crecimiento de células objetivo en un medio de ensayo; y

(b) añadir células efectoras y el anticuerpo a las células objetivo; en donde una disminución en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo es indicativa de que el anticuerpo se enlaza a un antígeno apical sobre las células objetivo.

“Siguen 12 páginas de dibujos”